核酸检测篇4-Real-Time PCR

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1、编号：2-5主题：Real-TimePCR概述：Real-TimePCR技术，又称实时定量荧光PCR(real-timequantitativePCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。Re

2、al-TimePCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。常用方法：SYBRgreen（荧光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）。目的：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。原理：1.SYBRgreen（非特异性荧光标记）:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2.TaqmanProbe（特异性荧光标

3、记）:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。步骤：1.RNA抽提（以细胞样品为例，操作步骤同RT-PCR）1.1弃去培液，PBS洗2遍，加入1mlTrizol

4、，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入1.5mlEP管内，静置5min。（Trizol量根据细胞密度可适当调整，建议：6孔板细胞长满~1mlTrizol）1.2加入200μl氯仿（三氯甲烷），用手剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟。（氯仿量为1/5Trizol）1.312000g，4℃，离心15min。1.4仔细转移上层水相到1个新EP管中，不能贪多，约400-500μl。1.5加等体积异丙醇，轻柔混合4～5次，室温放置10分钟。1.612000g，4℃，离心10min。1.7轻轻倒去上清，用20μl枪轻轻吸去残液，

5、沉淀用1ml75%乙醇（0.75ml无水乙醇＋0.25mlDEPC水，现配）洗1～2次，涡旋混匀。1.8吸去上清，5-10分钟空气干燥RNA。（肉眼不能明显看到水分即可）1.9加15-20μlDEPC水，吹打数次，测浓度。注释：mRNA不稳定，很容易讲解，因此mRNA提取过程中要尽量避免RNA酶污染。2.反转录（参照商品化试剂盒说明书）3.定量PCR实验（具体参数设置请参照商品化试剂盒说明书）（1）PCRreactionmix的制备(在冰上操作)；（2）将8联管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部；（3）

6、PCR反应，采用了标准的三步法程序进行反应（4）在PCR反应后，进行熔解曲线分析4.定量PCR数据分析（1）定量PCR试验原始数据（2）内参基因在不同样本中的数据分析（3）目的基因表达量分析（4）表达差异的计算