赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因的克隆及rna干扰研究

《赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因的克隆及rna干扰研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、刘亚萍赤拟谷盗两种细胞内钙离子基因的克隆及RNA干扰研究赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因的克隆及RNA干扰研究摘要赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)属于鞘翅目(Coleoptera)拟步甲科(Tenebrionidae)拟谷盗属(Tribolium)，是一种危害严重的世界性农业粮食害虫，也是所有昆虫中系统性RNA干扰最有效的昆虫。鱼尼丁受体(RyanodineReceptor，RyRs)和l，4，5-三磷酸肌醇受体(Inositol1,4，5．TrisphosphateReceptor，IP3Rs)均是控制Ca2+从胞内钙库释放的四聚体钙离子通

2、道。鱼尼丁受体是新型杀虫剂氟虫酰胺和氯虫酰胺的作用靶标，1，4，5．三磷酸肌醇受体是开发新型高选择性杀虫剂的重要潜在靶标，但目前国内外有关昆虫鱼尼丁受体和1,4，5．三磷酸肌醇受体这两种细胞内钙离子通道基因结构与功能的研究还相对滞后，并且对其在昆虫生长发育过程中的作用尚无报道。本文克隆了赤拟谷盗鱼尼丁受体和l，4，5．三磷酸肌醇受体基因，分析了二者在赤拟谷盗不同发育阶段的表达模式，并在此基础上利用RNA干扰技术对其功能进行了研究。研究结果对进一步提高对昆虫细胞内钙离子通道结构和功能关系的认识以及新型高效杀虫剂的创制具有重要的理论意义和实践价值。通过反转录多聚

3、酶链式反应技术(RT-PCR)克隆了赤拟谷盗RyR和IP3R全长cDNA序列，分别命名为TcRyR和TclP3R。TcRyR开放阅读框长15285bp，编码5094个氨基酸残基，预测蛋白质分子质量577．09Kda。TcRyR和褐飞虱Nilaparvatalugens、家蚕Bombyxmori、果蝇Drosophilamelanogaster同源基因的氨基酸序列一致性分别为81．5％、82．2％、78％。作为Ca7+释放通道的孑L道形成区域(pore-formingsegments)一部分的GXRXGGGXGD基序在TcRyR(4943．4952)中高度保守

4、，在Ca2+释放通道传导中具有重要作用的家兔RyRl的14897，R4913和D4917氨基酸残基也发现于TcRyR中(14950，R4966和D4970)，表明TcRyR可形成功能性钙离子释放通道。分别位于TcRyR蛋白c末端4181—4208和4216．4243的两个EF．hands表明TcRyR与哺乳动物RyRs相似，可以调节细胞内Ca=+释放。TclPsR开放阅读框长8172bp，编码2724个氨基酸残基，预测蛋白质分子质量308．68Kda。氨基酸序列比对表明，TclP3R与果蝇Drosophilamelanogaster、埃及伊蚊Aedesaeg

5、ypti的IP3R序列一致性分别为69．4％、70．0％。小鼠IP3R1的IP3结合孔道结构域内负责正确识别IP3的11个氨基酸残基(265R，266T，267T，268G，269R，504R，508K，511R，567Y，568R及569K)在TclP3R中高度保守(267R，268T，269T，270G，271R，496R，500K，503R，560Y，561R，562K)。保守性结构域分析发现，TcRyR和TclP3R具有共同的结构特征，包括氨基11扬州大学硕士学位论文端的SD(suppressor—domain-likedomain)结构域、MIR(

6、甘露糖转移酶Mannosyltransferase，IP3R和RyR)结构域、两个RIH(RyRandIP3RHomology，RyR和IP3R同源)结构域和RIH相关(RIH-associated)结构域以及羧基端的6个跨膜结构域。此外，与哺乳动物RyRs一样，TcRyR还含有3个SPRY结构域(SPla和RyR)和4个RyR结构域。分别将TcRyR和死护根的cDNA序列与gDNA序列比对分析发现，TcRyR基因组结构中包含55个外显子，而Tc_IP3R基因组结构中包含26个外显子。除了TcRyR第7内含子5’剪接位点为GC外，TcRyR和TclP；R内含

7、子57和3’剪接位点都符合GT．AG规则。此外，结合cDNA多重序列比对发现，在TcRyR和TclP3R基因中分别发现一个选择性剪接位点。通过荧光定量PCR研究了TcRyR和TclP3R在赤拟谷盗不同发育阶段的mRNA表达水平。结果发现，TcRyR在1日龄雌虫中的表达量最高，而卵、幼虫和蛹期的表达无显著差异。TclP3R在1日龄幼虫中的表达最高，3日龄卵的表达最低。RNA干扰实验发现，当死R馏基因在晚期幼虫被抑制表达时，所有个体都能正常完成羽化，但有65．94％的成虫后翅不能正常折叠，并且所有成虫个体均不能正常爬行而在两周后全部死亡，表明鱼尼丁受体在赤拟谷盗

8、后翅折叠及行动能力中发挥重要的调控作用。当TclP3