人肝癌细胞株bel-7404核酸适配体筛选及其性质考察

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1、学校代号：10532学号：S10111140密级：湖南大学硕士学位论文人肝癌细胞株Bel-7404核酸适配体的筛选及其性质考察学位申请人姓名：刘小丹导师姓名及职称：王柯敏教授郭秋平副教授培养单位：化学化工学院专业名称：分析化学论文提交日期：2013年5月28日论文答辩日期：2013年5月31日答辩委员会主席：陈金华教授TheAptamersSelectionofHumanHepatocarcinomacellBel-7404andCharacterizationoftheAptamersbyLIUXiaodanB.S.(HainanUniversity

2、)2010AthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofScienceinAnalyticalChemistryintheGraduateSchoolofHunanUniversitySupervisorProfessorWANGKeminAssociateProfessorGUOQiupingMay,2013湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论

3、文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密□。（请在以上相应

4、方框内打“√”）作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日I硕士学位论文摘要肝癌是最常见且发病率较高的恶性肿瘤之一，根据来源不同可分为肝细胞癌、胆管细胞癌和混合细胞癌，其中肝细胞肝癌占85~90%。胆管细胞癌是指源于肝外胆管，包括肝门区至胆总管下端的恶性肿瘤。目前肝癌的临床发现和诊断基本上是建立在影像学方法检查组织和细胞的形貌基础上，难以实现早期诊断。同时治癌药物缺少针对癌细胞的特异性，且毒副作用大。在此背景下，cell-SELEX技术因其独特的优势得到了快速的发展，为解决上述问题提供了一种新思路。其产物核酸适配体具有分子量小、易合成和修饰、毒性小、

5、稳定性好、亲和力高和特异性强等特点，为恶性肿瘤等重大疾病的诊断和治疗提供了一种新的、理想的分子工具，在生物医学和临床研究中具有良好的应用前景。本工作基于cell-SELEX技术，以人肝癌细胞株Bel-7404为靶标，开展能特异性识别靶标的核酸适配体的筛选工作，对获得的核酸适配体进行了一系列的性质考察，并进行了初步的应用。研究内容包括：（1）人肝癌细胞株Bel-7404核酸适配体的筛选以人肝癌细胞株Bel-7404为靶细胞，人胆管癌细胞QBC-939为对照细胞进行筛选。我们首先对退火温度等实验条件进行了优化。随着筛选轮数的增加，加入反筛选的过程，同时筛选

6、的条件也逐渐变严格。总共进行15轮筛选后，对富集的筛选文库进行亲和力考察，选取进入结合能力饱和平台的第15轮筛选文库进行克隆测序和同源性分析，经过挑选和初步验证，获得4条核酸适配体序列能够很好地识别人肝癌细胞株Bel-7404。（2）人肝癌细胞株Bel-7404核酸适配体的性质考察及其应用为了使筛选得到的核酸适配体更好地用于以后的肝癌细胞检测和分析等方面，我们利用流式细胞术考察了核酸适配体的结合常数、细胞特异性、温度稳定性及蛋白酶消化作用的影响。另一方面，为了使核酸适配体更好的应用于复杂生物体系的成像研究，我们进一步优化了核酸适配体的序列和结构，并进行

7、了肝癌组织切片的识别。实验结果表明同时核酸适配体与人肝癌细胞株Bel-7404结合具有亲和力高、特异性强、温度稳定性好且不受酶作用影响的特点，这些信息为以后的应用打下了基础。同时，通过优化，核酸适配体的序列长度由79nt减少至37nt，与细胞的亲和力也得到提高，更重要的是优化所得的序列能够很好的识别Bel-7404肿瘤组织切片。关键词：核酸适配体；SELEX；肝癌；早期诊断II人肝癌细胞株Bel-7404核酸适配体的筛选及其性质考察AbstractLivercancerisoneofthemostcommonandmalignanttumors.Itc

8、anbeclassifiedintohepatocellularcarcinoma,chola