猴头菇多糖对胃肠黏膜保护作用的实验研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名—鳐日期：加垆J，月(妒关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药

2、大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名论文导师签名辙日期凶垆年厂月帅中文摘要中又捅要目的：通过观察猴头菇多糖对无水乙醇、吲哚美辛、醋酸、水浸拘缚所致大鼠胃黏膜损伤的作用，研究猴头菇多糖对胃黏膜的保护作用及其作用机制，并指导配方中的有效添加剂量；通过观察猴头菇多糖对LPS诱导Caco．2细胞及Caco一2／RAW264．7共培养体系应激炎症反应的保护作用，在细胞水平研究猴头菇多糖对肠黏膜屏障的保护作用。方法：l、

3、猴头菇多糖对胃黏膜保护作用的实验研究采用无水乙醇致大鼠胃黏膜损伤模型观察猴头菇多糖对急性胃黏膜损伤的保护作用，动物随机分成空白对照组、模型组对照组、阳性对照组、猴头菇多糖各剂量组。以猴头菇多糖的人体最小参考剂量(0．29／d)的5倍作为大鼠的最小给药剂量(HEPl)，人体最大参考剂量(0．49／d)的20倍作为最大给药剂量(HEP4)，再在最大、最小剂量间再设置2个梯度(HEP2、HEP3)。剂量设置分别为：HEPl17mg／kg，HEP268mg／kg，HEP3102mg／kg，HEP4136mg／kg。实验以无水乙醇模型大鼠

4、的胃黏膜溃疡指数为根据筛选出有效剂量。在筛选出有效剂量的基础上，分别采用吲哚美辛、醋酸、水浸拘缚致大鼠胃黏膜损伤模型以进一步观察猴头菇多糖对胃黏膜的保护作用并探讨其保护机理。SD大鼠，雄性，180—2209，随机分空白对照组、模型组对照组、阳性对照组、HEP剂量组。灌胃给药1次／d，共lO天，对照组给予等量蒸馏水。(1)末次给药1h后，除空白组外，动物灌胃吲哚美辛80mg／kg，空白组给予等体积蒸馏水。7h后处死动物，取出全胃，测量胃黏膜溃疡面积，酶联免疫法测定胃黏膜组织匀浆上清中的前列腺素(PGE2)、表皮生长因子(EGF)含

5、量。(2)给药前，以微量注射器平刺入浆膜注射30％醋酸制备大鼠慢性胃黏膜损伤模型，末次给药后禁食24h处死动物，取出全胃，测量胃黏膜溃疡面积，酶联免疫法测定胃黏膜组织匀浆上清中的碱性成纤维生长因子(bFGF)含量，实时荧光定量RT-PCR法测定转化生长因子(TGF．Q)mRMA表达的影响。(3)末次给药O．5h后固定于金属网笼内，直立浸于水温20士1℃的水槽中6h制备大鼠应激性胃黏膜损伤模型，10％水合氯醛麻醉动物，于剑突下正中切开腹前壁，于胃体及胃窦处各作一个长度0．5cm的横向切口，运用激光多普勒灌注监视仪测定胃体及胃窦处血

6、流量(GMBF)。以激光多普勒信号表示血流量的相对数值，以胃体及胃窦处血流量均值表示胃黏膜血流量；处死动物，取出全胃，测量胃黏膜溃疡面积。2、猴头菇多糖对肠黏膜保护作用的实验研究：将Caco一2细胞以105浓度接种在Transwell转运培养槽的微孔滤膜上进行培养，培养基为DMEM高糖(pH7．4，含10％胎牛血清，2mmol·L～L．谷氨酰胺，10mmol·L～Hepes、NEAA、青链霉素)，于37。C，5％C02培养箱中培养24h换液，以后每隔48h换液，约4-6d细胞融合达90％进行传代。采用形态学观察、跨膜电阻测定、表

7、观渗透系数测定和碱性磷酸酶活性检测对细胞模型进行评估。以脂多糖(LPS)刺激1h引起Caco一2细胞及Caco．2／RAW264．7共培养体系应激炎症反应，加入猴头菇多糖干预24h，收集下侧转运液检测相关炎症因子的分泌情况。(1)细胞培养至15d，光镜下观察细胞分布均匀，边界清晰，以单层致密的方式排列时，耳P．--I进行实验。在Transwell板上部加LPS50pg／ml，lh后在上部加入猴头菇多糖500pg／ml，24h后取下侧培养液酶联免疫法测定细胞因子IL．6，IL一8，IL．10，IL一12，TNF．Ⅱ，IFN吖的含量

8、。(2)细胞培养至15d，光镜下观察细胞分布均匀，边界清晰，以单层致密的方式排列时，在Transwell板下部以105接种小鼠单核巨噬细胞(洲264．7)，共培养24h。在Transwell板上部加LPS50pg／ml，lh后再加入猴头菇多糖500btg／ml，