铜绿假单胞菌生物被膜耐药性分析及tola、ndvb基因检测

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1、万方数据中图分类号UDCR446．5610硕士学位论文学校代码密级10533铜绿假单胞菌生物被膜耐药性分析及tolA、ndvB基因检测Analysisofhigh--levelantibioticresistanceandtheexpressionoftolA，ndvBinPseudomonasaeruginosa作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：biofilms李艳华临床医学临床检验诊断学湘雅医院刘文恩教授答辩委员会主席中南大学二。一四年五月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导

2、师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特N,Dn以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：查幽日期：盟年』月盟日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和

3、借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：导师签名斟蚣万方数据硕士学位论文中文摘要铜绿假单胞菌生物被膜耐药性分析及tolA、ndvB基因检测摘要目的：(1)了解临床分离的铜绿假单胞菌形成生物被膜的能力及形成生物被膜后的耐药性变化；(2)探讨tolA、ndvB两耐药基因在铜绿假单胞菌浮游菌和生物被膜菌的分布和表达，以期为生物被膜菌感染治疗策略提供新的研究方向。方法：(1)收集临床分离的铜绿假单胞菌60株，Vitek-2全自

4、动微生物分析系统鉴定菌种。采用微孔板构建生物被膜模型，甲醇固定、结晶紫染色后显微镜观察生物被膜镜下形态，筛选出生物被膜阳性的菌株。聚合酶连反应(PCR)检测所有试验菌株的tolA和ndvB基因，并对基因扩增产物进行测序和BLAST分析。(2)采用微量肉汤稀释法测定生物被膜菌和其浮游菌妥布霉素、庆大霉素和阿米卡星的MIC值，比较生物被膜菌MIC值较浮游菌MIC值的倍数变化。(3)实时荧光定量PCR检测生物被膜菌和浮游菌tolA和ndvB基因相对表达量，采用配对t检验对生物被膜组和浮游菌组tolA、ndvB基因表达水平进行差异显著性检

5、验，P<0．05具有统计学差异。结果：(1)60株I临床分离铜绿假单胞菌经结晶紫染色筛选出生物被膜阳性58株，阳性率97％；所有菌株tolA、ndvB基因扩增结果阳性，测序结果与GenBank上己公布基因序列比对同源性均≥99％。(2)生物被膜妥布霉素MIC提高1～1024倍，庆大霉素MIC提高O～>1024倍，阿米卡星MIC提高1～>256倍，其中妥布霉素、庆大霉素和阿米卡星分别有12、20和15株PA成膜前后因耐药严重均未测出确定MIC值。(3)生物被膜组ndvB基因的相对表达量较浮游菌组明显上升(P

6、olA基因的相对表达量与浮游菌组差异无统计学差异(户O．16)。结论：(1)几乎所有临床分离的铜绿假单胞菌均具有形成生物被膜的能力。tolA和ndvB基因存在于所有铜绿假单胞菌，是铜绿假单胞菌全基因组序列的组成部分。(2)临床菌株形成生物被膜后高水平耐药，对氨基糖苷类抗生素的耐药水平可提高几倍至上千倍。(3)ndvB基因表达上调普遍存在于生物被膜菌，对生物被膜菌耐药性发挥着重要作用，有望成为抗菌药物作用的新靶点；tolA基因在被膜菌表达无变化，可能该耐药机制在被膜菌表达上调仅存在个别菌株，仍需要大样本检测证实。II万方数据硕士学位

7、论文中文摘要关键词：铜绿假单胞菌；生物被膜；高水平耐药性；tolA；ndvB分类号：R446．5III万方数据硕士学位论文英文摘要Analysisofhigh--levelantibioticresistanceandtheexpressionoftolA，ndvBinPseudomonasaeruginosabiofilmsAbstractObjectives：(1)AssessingthecapabilityofbiofilmformationbyclinicalstrainsofPseudomonasaeruginosain

8、vitro，andthechangeofantibioticresistanceinbiofilms．(2)Analyzingthedistributionandexpressionofantibioticresistancegenes，tolAa