鳜鱼泛素连接酶基因的克隆、表达及功能研究

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1、中山大学硕士学位论文鳜鱼泛素连接酶基因的克隆、表达及功能研究姓名：张慧申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：何建国20070609张慧中山大学硕士学位论文鳜鱼泛素连接酶基因的克隆、表达及功能研究专业：水生生物学硕士生：张慧导师：何建国教授中文摘要鳜鱼(SinlpercaChuatsi)是我国重要的养殖品种，而近年来传染性脾肾坏死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)对鳜鱼养殖造成了严重的经济损失．为了研究病毒与宿主的相互作用，在ISKNV感染鳜鱼的抑制性消减杂交eDNA文库基础上，经NCBI数据库比对分析后发现有一个与泛

2、素连接酶E3基因序列比较相似的EST(expressedsequencetag,EST)．泛素连接酶E3是uPP(ubiquitinproteasomepathway)途径中一种重要酶，对底物蛋白的特异性识别起重要作用。根据以上EST，通过eDNA末端快速扩增技术成功获取了鳜鱼E3基因的eDNA全长。该基因eDNA全长3833bp。有一个330bp的5，非翻译区(5'-UTR)和一个932bp的3’非翻译区(3'-UTR)，在3’非翻译区有一个很典型的加尾信号(AATAAA)．E3全长eDNA含一个长达2571bp的开放阅读框(openreadingframe，ORF)，编码856个

3、氨基酸的蛋白质，经生物信息学分析，预测该蛋白分子量为98195．52Daltous，等电点为5．054。比对发现该蛋白为一种E6-AP的泛素连接酶，在其C端有一个保守的约350个氨基酸的HECT(HomologoustotheE6-APCarboxylTerminus)结构域。实时荧光定量PCR检测组织分布的结果显示。该E3基因几乎在各个组织中都有分布．其中，血细胞中的含量最高，而腮中最张慧中山大学硕士学位论文少。进行了鳜鱼E3的大肠杆菌原核表达。以pGEX-4T-1原核表达载体成功构建了pGEX-E3质粒并分别转化BL21(DE3)后获得了目的蛋白的高效表达，且表达蛋白可溶性良好。

4、．蛋白印迹实验证实了正确表达了目的蛋白．为了进一出研究该基因的功能，采用经典的体外泛素化实验，验证该E3泛素连接酶的活性．采用UbcH2，UbcH3，UbcH5a,UbcH5c,UbcH7，UbcH9,UbcHl0，UbcHl2,E2．MFC鳜鱼E2)8种不同类型的泛素聚合酶E2与该E3进行体外泛素化实验，发现其可以与UbcH5a以及UbcH7协作完成体外泛素化；另外还跟鳜鱼的自身的泛素聚合酶E2作用，并且两者之问体外泛素化作用最强．这些结果表明该蛋白具有E3泛素连接酶活性。本文首次从鳜鱼中获得E3全长eDNA序列，并证明了其泛素连接酶活性。uPP途径是生命活动过程中重要的蛋白代谢途

5、径之一，因此，本文为uPP途径在鳜鱼体内生理作用的研究奠定了坚实的基础，同时也为进一步研究鳜鱼与病毒侵染过程中uPP途径的作用开拓了方向，对于研究ISKNV与宿主问的相互作用具有重要的意义。关键词：鳜鱼，泛素连接酶，体外泛素化Ⅱ张慧中山大学硕士学位论文Molecularcloning，expressionandfunctionalreasearhofubiquitinligaseE3frommandarinfish，SinipercaChuatsiMajor：HydrobiologyMastercandidate：ZhangHlliSupervisor：ProfessorHeJian

6、guo，Ph．DInthelastdecade,sig

7、1iljcameconomiclossesinculturedmandarinfish，Sinipercachuatsi，havebeenattn'butedtooutbreaksofinfectiousspleenandkidneyneurosisvirus(IsⅪqv)．Inordertostudytheinteractionbetweenthevirusandthehost,suppressionsubtractivecDNAhnorarieswere：constructedfromspleensofmock-andISK

8、NVinfectedmandarinfishinourlab．AcomplementaryDNA(cDNA)fragmentwithsequencesimilartoubiquitinligaseE3，aproteinthathasakeyfunctioninrecognizingthesubstratesinuPP(ubiquitinproteasomepathway)．wasthenchosenfromthislibraryforfurtherstud