绵羊肺腺瘤病相关基因突变的检测及绵羊、山羊内源性反转录病毒的扩增

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1、分类号S852.3学校代码10129UDC578学号2009301022绵羊肺腺瘤病相关基因突变的检测及绵羊、山羊内源性反转录病毒的扩增GeneMutationDetectionRelatedtoOPAandSequence，，AnalysisofGoatsandSheepsenJSRV申请人：周艳喜学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：动物分子病理学指导教师：马学恩教授论文提交日期：二〇一二年四月摘要研究背景：绵羊肺腺瘤病(ovinepulmonaryadenomatosis,OPA)是一种由绵羊

2、肺腺瘤病病毒（jaagsiektesheepretrovirus,JSRV）引起的肺脏肿瘤性疾病。病原JSRV为β反转录病毒。自然感染绵羊潜伏期为2～24个月,人工感染绵羊潜伏期为3～7个月，患病绵羊病死率为100%。世界动物卫生组织将该病列为B类传染病。JSRV的Env蛋白是在体内和体外起主要作用的癌蛋白，有研究表明PI3K/AKT和RAS-MEK-MAPK是JSRVEnv蛋白转化细胞的信号通路。建立特异、快速诊断方法是本病防控的基础。病毒致病机制的研究是深入了解本病的重点。研究目的方法：建立特异性诊断

3、OPA的方法和研究OPA与癌症相关基因突变的关系。本实验在JSRV结构基因研究的基础上参照GenBank中登录的JSRV基因序列，针对编码Env蛋白YXXM基序列设计了特异性PCR引物，建立了PCR检测方法，并对保存的病料进行了检测。参照SANGER、UCSC、GenBank数据库对nras、kras、pik3ca、egfr、p53基因发生突变较高的位点的外显子进行扩增。应用SSCP-PCR技术对扩增产物进行分析，对疑似突变的扩增产物进行测序检测。参照GenBank中登录的enJSRV基因序列，设计三对特

4、异性引物扩增出一株绵羊内源性肺腺瘤反转录病毒和一株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒基因片段。以山羊基因组DNA为模板，应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段，分别连接PMD-18T载体并测序。利用MethylPrimerExpressv1.0查找绵羊和山羊enJSRV启动子区CpG岛，各设计一对甲基化引物和一对非甲基化引物。以处理的绵羊和山羊基因组DNA为模板，检测绵羊胎儿不同组织基因组DNA的甲基化情况，和不同山羊组织基因组DNA甲基化情况。构建含enJSRV的pro、env融合基因的真核表达载体EGFP-

5、enpro、pcDNA3.1-enenv并在小鼠肺上皮细胞系TC-1中表达。实验结果：（1）建立的特异性PCR检测方法，具有高的特异性、重复性，可检测出最低10～20拷贝的JSRV前病毒DNA。检测出JSRV阳性样品10例。（2）应用PCR-SSCP检测法,对10例JSRV阳性样品和10例阴性样品进行检测，结果在2例阳性标本中发现kras基因第二外显子第12氨基酸杂合型突变，CDS突变35G〉T，氨基酸突变G12V。1例阳性样品检测出p53基因第7外显子杂合型突变，CDS突变825T>C,氨基酸未发生突变

6、C275C。（3）完成了一株绵羊内源性肺腺瘤病毒和一株山羊内源性肺腺瘤病毒基因序列的测定和序列分析，结果显示测得的绵羊enJSRVN序列与enJSRV-20（EF680302.1）病毒株的核苷酸同源性为99.4%，与外源性绵羊肺腺瘤病毒JS7(AF357971.1)病毒株的核苷酸同源性为90.9%。测得的山羊GERV序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-5（EF680305.1）的核苷酸同源性为94.2%，与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7（AF357971.1）的核苷酸同源性为88.1.%。扩增的绵羊

7、和山羊内源性反转录病毒的同源性为93.1%。对enJSRV基因启动子甲基化检测，结果显示绵羊和山羊不同组织中均存在甲基化与非甲基化修饰的病毒启动子。（4）经过酶切鉴定pro、env基因成功连接入真核表达载体pEGFP-C1和pcDNA3.1（+），蛋白免疫荧光和WesternBlot方法检测显示重组质粒、EGFP-enpro、pcDNA3.1-enenv能够在真核细胞中瞬时表达。结论：(1)本研究建立了JSRV的特异性检测方法，对OPA的早期诊断和防控具有实用价值。(2)检测到JSRV感染绵羊肿瘤组织基因

8、组中kras、p53基因突变，对研究OPA的致病机制具有重要参考价值。(3)成功扩增出一株绵羊和一株山羊enJSRV基因序列，检测了绵羊和山羊enJSRV启动子区的甲基化修饰情况。（4）分别构建了包含enJSRV的pro、env基因的真核表达质粒，为研究enJSRV的功能和抑制JSRV感染的作用奠定了基础。关键词：检测方法；基因突变；序列分析；甲基化；绵羊肺腺瘤病GeneMutationDetectionRelatedtoOP