组化第三章酶组化

《组化第三章酶组化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章酶组织化学方法第一节概述酶是生物体内具有催化作用的特异性蛋白质，细胞内新陈代谢的合成和分解的生物化学反应都有酶的参与，因此，又称其为生物催化剂。组织化学中的酶反应是指在一定的条件下，使组织细胞内的酶通过作用于酶的底物，使后者被分解形成某种初级反应产物，这种产物被捕捉剂所捕获而沉淀于原位上，然后将这种沉淀物变成具有可见性的最终产物，从而间接证明酶的定位。酶＋酶的底物最初的反应物＋另外物质（金属盐）不溶于水的显色产物酶的分类：1.氧化还原酶：是催化氧化还原反应的酶。2.转移酶:是催化功能基团转移的酶。3.水解酶:是催化水解反应的酶。4

2、.裂解酶:是催化分裂或合成化合物的酶。5.异构酶:是催化同分异构体相互转化的酶。6.合成酶:是催化将两种物质合成一各物质,并必须与ATP分解相偶联的酶。酶组织化学反应中注意事项在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好组织细胞的形态结构，以保证酶在组织细胞中准确定位。酶反应的温度、时间、PH必须控制好。试剂的浓度配制必须准确。所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。必须做阳性或阴性对照试验。第二节若干酶组织化学反应程序一、碱性磷酸酶（一）名称：常用名：碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）水

3、解酶，在碱性环境下催化水解磷酸脂生成磷酸和醇。在运输较为活跃的细胞膜上广泛分布，如毛细血管内皮细胞、肝内毛细胆管膜、肾近曲小管的刷状缘、肠上皮的纹状缘和神经细胞的突触膜等。(二)反应原理：ALP在有激活剂（Mg2+）存在和PH9.4时，将其磷酸盐底物（如β一甘油磷酸钠、α一苯酚磷酸钠）分解产生甘油钠和磷酸离子，后者被孵育液中的氯化钙所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，但为非金属盐，需要加入硝酸钴，从而生成无色磷酸钴沉淀，再通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴。（三）光镜显示法Gomori改良钙钴法1）溶液的配制：①孵育液：3％β－甘油磷酸

4、钠10ml2％巴比妥钠10ml2％氯化钙（2.7%CaCl2·2H2O）20ml5%硫酸镁(MgSO4·7H2O)1ml蒸馏水5ml调此液pH至9.4,可冰箱保存。②2％硝酸钴（Co(NO3)2）③0.5%硫化铵((NH4)2S)(新配)2)染色步骤:①石蜡切片脱蜡入水,或冰冻切片或经10%福尔马林固定15min;②入孵育液,37℃30-40min(肾组织10min,肝组织60min);③流水冲洗5min;④2%（Co(NO3)2)5min;⑤蒸馏水洗;⑥1%(NH4)2S1min;⑦蒸馏水洗;⑧甘油明胶封片;3）对照:孵育液中去除β-甘

5、油磷酸钠。4）染色结果：ALP活性的最终反应产物为棕黑色硫化钴沉淀。5）说明：钙钴法在一般实验室仍是常用的方法，但因其化学反应多次转换，容易造成定位不准确；石蜡切片虽然也能显示ALP活性，但经石蜡包埋处理（包括酒精、二甲苯、高温等），酶活性丧失大部分。二、酸性磷酸酶（一）名称：常用名：酸性磷酸酶（acidphosphaatase,ACP）主要位于细胞内的溶酶体内，是溶酶体的标志酶。此外，尚有非溶酶体性ACP。ACP在细胞退变过程中活性最强，在核酸和蛋白质代谢活动增强时，也见ACP活性增强。ACP也参与脂肪代谢。在神经传导冲动时，ACP参与

6、Ca2+依赖的神经递质释放过程。总之，在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中ACP均具有一定的生物学意义。（二）反应原理显示酸性磷酸酶，先将切片放入含有酶底物（β-甘油磷酸钠）的溶液（PH5.0）中孵育，底物经酶水解，释放磷酸，用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅，沉淀于酶存在的部位，再用硫化铵处理，磷酸铅被置换形成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物，便可用光镜看到。（三）光镜显示ACP有铅法和偶氮偶联法：1、 铅法：1）孵育液的配制：0.05mol/L醋酸盐缓冲液,pH5.010ml蔗糖0.8g硝酸铅Pb(NO3)210mg3%(约0.1

7、mol/L)β-甘油磷酸钠1ml按上述顺序加入,待硝酸铅完全溶解后再逐滴加入底物,边加边搅至溶液完全透明。2)染色步骤：①石蜡切片脱蜡到水；冰冻切片或冰冻切片冷福尔马林钙固定10min后水洗；②入孵育液2～4h（肝组织1h左右），37℃；③双蒸馏水洗；④入1％硫化铵（新配）溶液内1～2min⑤流水洗。13）对照：在孵育液内加入0.01mol/L氟化钠(NaF)抑制剂后,ACP反应呈阴性。M4）染色结果：ACP呈棕黑色硫化铅颗粒。5）说明：ACP是可溶性酶，以冷固定后结果较满意.石蜡切片制作过程易使酶失活。三、５ˊ－核苷酸酶（一）名称常用名

8、：５ˊ－核苷酸酶（５ˊ－Nucleotidase）５ˊ－核苷酸酶是一种特异性的磷酸单酯酶，它能水解核糖核苷和去氧核糖核苷在Ｃ－5位置的磷酸酯，如一磷酸腺苷（ＡＭＰ），一磷酸肌苷（ＩＭＰ），尿苷