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中图分类号：R392-33硕士学位论文大鼠Trail基因慢病毒载体的构建及鉴定院（系）、所临床医学院研究生姓名张海学科、专业外科学导师姓名蒋正方教授二Ο一二年四月1 目录1大鼠Trail基因慢病毒载体的构建及鉴定…………….21.1.1中文摘要………………………………………………2-31.1.2英文摘要………………………………………………3-41.2前言……………………………………………………4-51.3流程图............................................................................5-61.4.1实验材料………………………………………………6-91.4.2实验方法………………………………………………9-261.4.3实验结果……………………………………………..26-341.5讨论…………………………………………………...34-411.6结论………………………………………………….......421.7.1参考文献……………………………………………..42-431.7.2英汉缩略词对照表…………………………………..44-451.7.3致谢…………………………………………………...45-471.8TRAIL研究现状（综述一）„„„„„„„„„47-581.9慢病毒载体的构建与应用进展(综述二)………….大鼠Trail基因慢病毒载体的构建及鉴定摘要目的:本实验用PCR法扩增出的Trail基因引入慢病毒载体系统，生产Trail慢病毒颗粒并进行病毒滴度检测。方法:1.Trail基因的获得：根据2 GenBank中大鼠Trail基因序列(NM145681.1)，设计出该基因的特异性引物Trail-Agel-F和Trail-Agel-R，并且使用Agel酶的切位点。用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因。2.重组质粒的构建：采用In-Fusion技术，将酶切回收后的PCR产物线性交换连接入Agel酶切的真核表达载（GV218），产生目的重组质粒。连接产物质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，扩增目的重组质粒。3.连接产物的酶切鉴定：收集扩增后的连接产物，酶切后经电泳发现得到片段长度均与预期相符，基因测序结果亦正确，从而证明克隆Trail基因已成功。4.重组质粒转染293T细胞：用脂质体Lipofeetamine2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，三质粒共同转染293T细胞，产生含有表达Trail蛋白的Lentivirus病毒颗粒。5.病毒检测：重组质粒转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达，行Westernblot鉴定及使用Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:成功得到Trail目的基因，重组质粒测序结果与GenBank中Trail基因序列(NM145681.1)比较，证实Trail基因序列正确；三质粒转染293T细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光；WesternBlot检测观察到58KD附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合；孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2E十8TU/ml。结论:成功克隆大鼠Trail基因和成功构建慢病毒载体系统并检测其滴度。为后续把有杀灭肿瘤的基因（Trail）转导进神经干细胞奠定基础。关键词:慢病毒，载体，Trail，基因ConstructionandidentificationofratTrailgenerecombinantlentivirusvector3 .Abstract：Objective:thisexperimentusingthemethodofPCRamplifiedTrailgeneintoslowvirusvectorsystem,theproductionofTrailvirusparticlesandvirustiter.Methods:the1.Trailgenewasobtained:accordingtoGenBankinratTrailgenesequence(NM145681.1),todesignthegenespecificprimersofTrail-Agel-FandTrail-Agel-R,anduseAgelenzymecuttingsite.UsingthemethodofPCRfromratcDNALibraryoftheamplifiedgene.2constructionofrecombinantplasmids:usingIn-Fusiontechnology,theenzymerecoveryafterPCRproductslinearswitchedconnectionintotheAgelrestrictionofeukaryoticexpressioncarrier(GV218),generatingrecombinantplasmid.ConnectproductplasmidwastransformedintoE-coliDH5acompetentcellstorecombinantplasmid,amplification.3connectingproductrestrictionenzymeidentification:collectedafteramplificationconnectedproduct,enzymeafterelectrophoresisfragmentlengtharefoundtobeconsistentwithexpectations,genesequencingresultsarecorrect,thusprovingthecloningoftheTrailgenehasbeensuccessfully.4recombinantplasmidsweretransfectedinto293TcellsbyliposomeencapsulatedLipofeetamine:2000constructionofrecombinantplasmidandauxiliarypackagingcarrier,threeplasmidtransfected293Tcellsproduceacommon,expressingtheTrailproteinofLentivirusvirusparticles.5virusdetection:therecombinantplasmidtransfectedinto293Tcell,fluorescencemicroscopewasusedtoobservetheexpressionofGFP,WesternblotandReal-timeidentificationusingquantitativePCRassayfordetectionofvirustiter.Results:thesuccessofTrailgene,recombinantplasmidsequencesandthe4 GenBankTrailgenesequence(NM145681.1)Trailgenesequencecomparison,provedcorrect;threeplasmidtransfected293Tcellswasobservedbyfluorescencemicroscopyofgreenfluorescent;WesternBlotdetectionwereobservedin58KDnearthecharacteristicstrip,itssizeandpurposegenefusionproteincoincidewith;holedilutionmethodandrealtimefluorescentquantitativePCRdeterminationofvirustiterdeterminationresultsfor2Eten8TU/ml.Conclusion:successfulcloningofratTrailgeneandconstructionoflentiviralvectorsystemanddetectionofitstiter.Asafollow-uptothekillingoftumorgene(Trail)transductionintoneuralstemcellstolaythefoundation.Keywords:Lentivector,carrier,Trail,gene前言人类一直都在与恶性肿瘤作斗争，不懈地探索治疗方法,但到目前为止仍然没有找到非常完美的治疗手段。所以综合治疗成为现在主流的方法，它包括手术、化疗、放疗、生物治疗、内分泌治疗等。其中传统的主要疗法有三种(手术及化放疗)，但它们杀死肿瘤细胞的同时对正常组织细胞也有极大的损伤，这使得人们必须去探索新的更有效的治疗方法。随着对肿瘤发生、发展的机制的深入研究和生物科技的飞速发展，生物治疗逐渐引起人们的广泛关注和积极探索。近些年来，生物治疗尤其是其中基因靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中发挥了重要的作用。寻找有效的的细胞毒性分子诱导肿瘤细胞凋亡逐渐成为治疗恶性肿瘤的研究热点。将具有杀灭肿瘤细胞的基因转导进神经干细胞，利用后者的肿瘤趋化特点达到治疗目的，这5 是目前神经系统恶性肿瘤生物治疗研究中非常前沿的领域。本项实验研究就是在这个领域里一次很有意义的探索。本实验是这项研究其中一个步骤，即构建并鉴定一种大鼠Trail基因过表达慢病毒载体，为后续把有杀灭肿瘤的基因（Trail）转导进神经干细胞奠定基础。流程图引物设计合成↓目的基因PCR扩增、酶切表达载体酶切、纯化↓定向克隆连接、重组感受态细胞制备↓转化↓PCR鉴定转化子↓阳性克隆测序↓病毒包装辅助质粒高纯度质粒抽提↓目的基因过表达载体（病毒载体）↓6 共转染293T细胞→荧光显微镜观察→收集细胞提取蛋白↓↓病毒颗粒的包装、生产Western-blot检测↓目的基因表达情况病毒的收获、浓缩→病毒滴度检测实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源型号1kpDNAladderMarkerFermentas公司#SM0311250bpDNAladderMarker捷瑞公司DL250+,100T琼脂糖赛百盛公司GA4-100限制性内切酶NEB公司R0136VIn-Fusion™PCRCloningKitclontech639626TaqpolymeraseSinoBioE001-02BdNTPTakaraD4030APrimer捷瑞生物Plasmid抽提KitPromegaA1460BCAProteinAssayKitHyClone-Pierce23225Prestainedproteinmarker中晶公司SM0441ECL-PLUS/KitAmersham公司RPN2132DMSO上海生物试剂公司7 DMEMGIBCO12800-017脂质体2000Invitrogen11668-502.主要仪器：仪器名称仪器来源型号PCR仪AppliedBiosystems公司2740thermalcyclerpositiveclone测序美季生物技术ABI3730型稳压DNA电泳仪BioRad公司凝胶成像仪天能公司细菌摇床华利达设备公司HI-9211K细菌培养箱吉尔森移液器Gilson公司离心机（高速）HITACHI公司TGL-16G-A稳压电源（电泳用）上海Tanon科技有限公司EPS-300SDS-PAGE蛋白电泳仪上海Tanon科技有限公司VE-180蛋白转膜仪上海Tanon科技有限公司VE-186台式高速冷冻离心机艾本德公司5417R显微镜（荧光）OlympusMP-3.3RTVCO2培养箱三洋MCO-185离心超滤装置密理博公司ufc-910024医用X线胶片Kodak胶片显影粉及定影粉8 3.细胞株293T，为包装慢病毒的贴壁上皮样细胞,这种细胞培养条件为:完全培养基:高糖DMEM,10%胎牛血清;冻存液:胎牛血清或完全培养基,10%DMSO，贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。4.菌株大肠杆菌菌株DH5α。5.病毒载体（1）GV载体图谱：图-1（2）pHelper1.0载体图谱：9 图-2（3）pHelper2.0载体图谱：图-3实验方法1.目的基因获取用PCR法从含有目的基因的质粒钓取该基因，酶切目的载体，所得产物电泳回收再转化细菌感受态细胞。长出的克隆即为构建的目的质粒。1.2引物设计：10 根据GenBank中大鼠Trail基因序列，设计基因的特异引物，引入Agel酶切位点。Trail上游引物：Trail-AgeI-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCTTCCACCGGGAACCT;Trail下游引物:Trail-AgeI-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGCTCACACTCAACTGGGC含交换配对碱基、酶切位点（下划线标记的），表达增强序列（双下划线记的）以及目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因1.3PCR扩增Trail基因以吉凯公司提供的大鼠cDNA文库为模板，PCR法扩增Trail基因序列。PCR反应条件：在94℃预变性5min；然后进行30个循环的变性（30see、94℃）、退火又叫复性（30sec、55℃）及延伸(2min，72℃)如此反复循环30次；最后72℃保温10min。1.4DNA凝胶电泳及PCR产物回收将PCR产物在含EB的10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，切下分子量为IKb目的条带并回收，以备后用。DNA凝胶回收步骤如下:无菌刀片切下含有目的片段的琼脂块，放入离心管中之后称重，将其置入温水里直至胶完全溶解；加入异丙醇并混和均匀；把混合溶液倒入含收集管的离心柱内，离心后除去收集管内的液体；加BufferQG离心后倒去收集管内的液体，再重复两次离心操作后将离心柱转移至一个干净离心管；11 加入灭菌双蒸水于离心柱滤膜中央，静置，离心后则溶液中含有目的基因片段，并置于-20℃保存。2.重组慢病毒载体转移质粒的构建2.1PCR产物与GV218载体的连接回收PCR产物交换连接入酶切病毒载体。反应体系如下:试剂体积（μL）ddH2O12.45×Taqbuffer4dNTPs(2.5mM)1.6Primer（+）（10μM）0.4Primer（一）（10μM）0.4Template（10ng/μL）1Taqpolymerase0.2PCR引物说明:Primer(+):Ubi-FPrimer(一):EGFP-N-R2.2感受态细胞的制备于新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有LB培养基的烧瓶中，旋转摇床培养3小时；将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的聚丙烯管中，用冰块使管降温。离心后回收细胞并倒出培养液，以用冰预冷的CaCI2重悬每份沉淀，放置于冰浴上，再离心后回收细胞并倒出培养液，将细胞分装后放于-70℃冻存。2.3转化12 从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,解冻以后马上置于冰上，然后加入pBS质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。37℃水浴5分钟。向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。2.4阳性克隆的PCR鉴定反应条件：25℃30分钟→42℃15分钟PCR反应体系：反应体系(μL):阳性对照自连对照实验组13 ddH2O17.5-X-Y17.5-X17.5-X-Y10×In-Fusion交换酶缓冲液222In-Fusion交换酶0.50.50.5线性化载体DNAXXX纯化后PCR产物片段Y0YTotal202020说明：a)加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为：1：3~1：9之间b)阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因（同样带有交换臂）2.5连接产物质粒的提取离心收集细菌大约3ml；将预冷好的P1250ul加入其中，在震荡仪上高速震荡1min；再加入250ulP2，混匀；5min内将预冷的N3溶液350ul加入，快速温和混匀，直到出现散开的絮状沉积物；冰上静置2min之后在13，000rpm条件下离心10min，小心吸取上清液于蓝色的spin柱中，相同条件下离心1min丢弃流出液加入750ulPE，再次离心1分钟，弃流出液，第三次离心1min，丢弃流出液；让管内彻底干燥，将spin柱拿出，放在一支干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30ulMilliQH2O，或者ElutionBuffer，室温下静置2min；最后离心1min，收集质粒保存并可用来检测浓度。3．重组质粒的测序将阳性菌落用灭菌甘油管保种并置于-80℃保存，取出即可用来测序。4.重组质粒表达的检测：14 4.1蛋白样品制备4.1.1提取贴壁细胞总蛋白：除去培养液，并把瓶子立放置数分钟，使残余培养液聚集到瓶底，然后使用移液器将其吸走；也可以把瓶子倒置在吸水纸上，用吸水纸吸干培养液。每瓶细胞加3ml4℃预冷的磷酸盐缓冲液。平放轻轻摇动1min，然后弃去洗液。重复洗涤细胞三次以上以便除去培养液。把培养瓶置于冰上。按1ml裂解液加10μlPMSF，摇匀后放置于冰上。每瓶细胞加裂解液400μl，放置于冰上裂解30min，来回摇动培养瓶以便使细胞充分裂解。裂解完后，快速将细胞刮于培养瓶的一侧，然后将细胞碎片和裂解液一起d放入1.5ml离心管中。在4℃、12000rpm条件下离5min，收集离心后的上清液放于－20℃冰箱里保存；收集培养液中的细胞用来提取其中细胞总蛋白的：方法是将培养液置入15ml离心管中，在2500rpm条件下离心5min。弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后相同条件下再离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。用枪洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min。将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装好后置于－20℃保存。4.1.2组织中总蛋白的提取：把少许组织块放入1～2ml匀浆器中，用无菌剪将其剪碎。加单去污剂裂解液400μl倒匀浆器中，匀浆之后置于冰上。裂解30min后，就可以使用移液器把裂解液移到1.5ml离心管中，再在4℃下12000rpm离心5min，取上清液分装并置于－20℃冰箱中保存。15 4.2蛋白含量的测定4.2.1标准曲线的制作从－20℃取出1mg/mlBSA，于室温下融化后。取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。并在各管中加入各种试剂。混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppentoff）上比色分析。4.2.2检测样品蛋白含量取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。取一管考马斯亮蓝加95ml0.15mol/LNaClNaCl溶液和5ml待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。4.3SDS-PAGE电泳4.3.1清洗玻璃板：玻璃板两面经擦洗后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗干净后立位晾干。4.3.2制胶与上样对齐玻板，然后垂直卡在架子上准备灌胶。按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一16 层水。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。测完蛋白含量后，计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。4.3.3电泳电泳时间一般为4～5hs，电压为40V或60V。终止电泳指针为溴酚兰刚跑出时。4.4转膜戴无菌手套，用镊子夹住切好的在水上浸润2h后的硝酸纤维素膜，将膜小心放置于有超纯水的平皿里，使膜浮在水面上，在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸并用玻棒擀去其中的气泡。之后先撬掉小玻璃板，再轻轻刮除浓缩胶，尽量避免刮破分离胶。把剥下分离胶置于滤纸上，并与之对齐用玻棒擀去气泡。将膜盖满于整个胶上并除去气泡。在膜上盖3张滤纸并再次除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中17 进行，要不断的擀去气泡。将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时槽里的需置冰块来降温。一般用60V转移2h或40V转移3h。转完后将膜用丽春红染液浸泡并在脱色摇床上摇5min。最后将用水冲洗后的膜晾干备用。4.5免疫反应用TBS从下向上把转好的膜浸湿后，放到含有封闭液的平皿中，在室温下置于脱色摇床上封闭摇动1h。在1.5ml离心管中将一抗用TBST稀释至适当浓度；在实验台面上铺保鲜膜，并用水浸湿以便使之保持平整；在其上加入抗体溶液；从封闭液中取出膜，残留液用滤纸吸去，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，注意不要残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗10min。同样用上述方法准备二抗妥当以后，就可以进行化学发光反应。4.6化学发光、显影及定影把准备好的试剂放在保鲜膜上等体积混合1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触60s后，把膜移至另一保鲜膜上，滤纸吸尽残液，包好并放入X-ray光片夹中。在暗室中，将显影液和定影液分别加入塑料盘中；在红灯下取出X-ray光片，剪裁至适当（比膜稍大）大小；打开X-ray光片夹，把膜置于X-ray光片下，关上X-ray光片夹，开始曝光计时；通常为1min至5min；曝光完成后取出X-光片，马上在显影液中显影，如果见到胶片上出现了明显条带就可以停止显影；显影结束后又迅速把X-光片放入定影液中浸泡大约5～10min，当看到胶片透18 明后停止；取出胶片并用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干即可。4.7凝胶图象分析经上述处理后的胶片就可以用来作凝胶图象分析。5.Lentivirus病毒包装：5.1培养病毒包装细胞293T5.1.1活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释100倍到200～2000个/ml，将0.1ml的0.4%的台盼兰溶液滴入0.1ml的细胞悬液中，混和均匀后，就可用血球计数板计数细胞。（注：因为活细胞要排斥台盼兰，所以染成蓝色的细胞是死细胞，用细胞总数减去蓝染细胞数就得到活细胞计数。）5.1.2细胞株的冻存用细胞培养液将生长旺盛的细胞（一般是培养2～3天的细胞）配成672×10～2×10/ml的细胞悬液。在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml小牛血清和0.1ml甘油，混匀后密封。置4℃1h，-20℃2h，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中冻存。5.1.3细胞复苏带上防护眼睛和手套，从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水的水浴中，并轻轻摇动使其快速解冻；然后移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10%FBS的DMEM培养基，放入培养箱。第二日需更换一次培养液继续培养。5.1.4细胞传代19 将有复苏细胞的培养瓶取出去除旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻摇晃后弃去PBS溶液。再加入胰酶消化液2ml直到细胞完全消化，通常只需1-2min。然后加入5ml含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM培养基，用刻度吸管将瓶壁上的细胞冲洗下来，混匀以后分装入两个新的培养瓶中，继续培养。5.2病毒包装在准备转染的1天前，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，消化后7调整细胞密度为0.6x10细胞/10ml，在含10%血清的培养基的15cm细胞培养皿中重新接种，之后放入37℃、5%CO2的培养箱里培养1天。等细胞密度达70%～80%后即可用于转染。转染前2h先去除培养皿中的血清培养基，然后加入无血清培养基。向一灭菌离心管中加入所制备的各种DNA溶液(Trail-LV载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg)1.25ml及相应体积的Opti-MEM混合均匀，在室温下温育5分钟。取100ul轻柔摇匀的Lipofectamine2000试剂在另一管中不混合，在室温下温育5分钟。把稀释后的DNA不稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀5分钟，混和均匀后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。再把混合液移至293T细胞的培养液中，于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。培养8h后倒去培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻柔晃动培养瓶以洗涤残余的转染混和物后弃去PBS液；每瓶细胞中重新加入含10%血清的细胞培养基25ml，放置于37℃、5%CO2培养箱内48小时。6.病毒的收获及浓缩20 收集转染后的293T细胞上清液。在4℃、4000g的条件下离心10min后除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液，并在超速离心管中放入40ml。把病毒粗提液样品取出15ml加入到过滤杯中，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。组合好以后保持平衡，在4000×g离心10-15nin，至需要的病毒浓缩体积。离心时间足够以后，取出离心装置，将将过滤杯倒扣在样品收集杯上。再次离心，持续时间为2分钟，离心力为1000×g，如果转速太高会造成样品损失。去除过滤杯，在样品收集杯中即得到病毒浓缩液。获得病毒浓缩液移后，即可分装在病毒管中，于-80度恒温冰箱中长期保存；亦可取出少许来做病毒生物滴度检测。7.病毒滴度检测7.1孔稀释法测定4测定前准备：铺板：在滴度测定1天前，准备96孔板，每个孔加4×10个细胞，体积为100μl。培养基：8-10支Ep管，可根据预期的病毒滴度，每支Ep管中可装上无血清培养基90μl。取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。在24小时后，加入完全培养基100μl。于4天后，观察荧光表达情况。7.2Real-time定量PCR法测定病毒滴度：基本步骤为：目的基因的查找和比对；引物、探针的设计；引物探针的合成；反应体系的配制；反应条件的设定；反应体系和条件的优化；荧21 光曲线和数据分析；标准品的制备7.2.1引物信息GFP引物被扩增的片段位置：211bp-496bpTmGC%上游引物序列：TGCTTCAGCCGCTACCC57.464.7下游引物序列：AGTTCACCTTGATGCCGTTC57.350.0ACTIN引物（NM_001101）被扩增的片段位置：932bp-1233bpTmGC%上游引物序列：GTGGACATCCGCAAAGAC52.655.6下游引物序列：AAAGGGTGTAACGCAACTA51.042.17.2.2具体步骤7.2.2.1样品制备5检测前一天，对293T细胞传代，每个24孔中加１×10个细胞，体积为500μl；第二天，准备7~10个无菌的Ep管，每管加入90μl的培养基（DMEM+10%FBS）；取待测定的病毒原液10μl加入到第一支管中，混和均匀后，取10μl加入到第二支管中。继续以上操作到最后一支管；选好需要的细胞孔，吸除90μl培养基，然后将稀释好的病毒液加入其中，置于培养箱中培养，培养条件是37℃及5%CO2；2天过后，加入新鲜培养基500μl。4天以后，提取RNA准备下一步实验。7.2.2.2总RNA抽提去除细胞上清，每孔加入1mlTRIZOL吹打，在室温下静置5分钟后转移到另一支新的1.5ml艾本德管中。每管加入200μl氯仿，用力摇晃15s，22 再次室温静置15min，然后在4℃及12000rpm条件下离心15min。从每支管中吸取上清到另一支新的1.5ml艾本德管。将-20℃预冷好的异丙醇放入1.5ml，混和均匀以后在-20℃温度下沉淀10min。相同条件下离心10min后，除去上清液。再加入1ml4℃预冷的75%乙醇，洗涤离心管。再次离心5min，除去上清液。还要离心5min，吸除残液，室温内干燥后加入20μlRNase-free水，混合至完全溶解，最后紫外分析测定所抽提RNA的浓度。7.2.2.3RNA逆转录将1μlOligodT(0.5μg/μl)和2.0μgTotalRNA加入到PCR管中，补充DEPC-H2O至9ul。混和后离心，于70℃温水中温浴10min。然后立即将PCR管插入到0℃冰水中，使之退火。按下面表中给定的比例，按反应管数可以计算出需要多少试剂。在冰上混匀M-MLV酶等之后得到RT反应液。在每支反应管中加入RT反应液11ul,混和均匀后再离心。试剂每管加入量5×RTbuffer4μl10mMdNTPs2μlRNasin0.5μlM-MLV-Rtase1μlDEPCH2O3.5μlRT反应在42℃时1h后完成，之后升温到70℃持续10min就能使RT酶丧失活性。得到的RT反应产物-cDNA就可用于PCR，也可冰冻（-80℃）保存。7.2.2.4Real-timePCR检测23 Real-timePCR反应体系：试剂每管加入量SYBRpremixextaq10μl上游引物（5μM）1.0μl下游引物（5μM）1.0μlcDNA1.0μl水7.5μl将程序设定为两步法定量。先行预变性95℃持续15S，然后95℃变性持续5S,60℃退火延伸持续30S,反复执行变性-退火-延伸，一共进行40次循环。在每次循环的延伸期读取吸光值。制作熔解曲线：PCR结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃每增加0.5℃，维持30S,同时读取吸光值。实验结果1．酶切产物：电泳图24 图-51#:1kbMarker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)2#:载体酶切产物3#:未酶切载体2.阳性克隆测序结果图-6阳性克隆测序结果图25 gb|EF030546.1|RattusnorvegicusTNF-relatedapoptosisinducingligandmRNA,completecdsLength=864GENEID:246775Tnfsf10|tumornecrosisfactor(ligand)superfamily,member10[Rattusnorvegicus](Over10PubMedlinks)Score=1591bits(861),Expect=0.0Identities=861/861(100%),Gaps=0/861(0%)Strand=Plus/PlusQuery1ATGGCTTCCACCGGGAACCTGAAGGGCCCCAGCTTCAGTCAGCACTTCACGATGACGGTG60||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1ATGGCTTCCACCGGGAACCTGAAGGGCCCCAGCTTCAGTCAGCACTTCACGATGACGGTG60Query61ATCTGCATAGTGCTCCTGCAGGTGCTCCTGCAGGCCTTGACTGTGGCTGTGACTTACATG120||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct61ATCTGCATAGTGCTCCTGCAGGTGCTCCTGCAGGCCTTGACTGTGGCTGTGACTTACATG120Query121TACTTCAACAACGAGGTGAAACAGCTACAGGACAATTACTCCAAAATCGGACTAGCTTGC180||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct121TACTTCAACAACGAGGTGAAACAGCTACAGGACAATTACTCCAAAATCGGACTAGCTTGC180Query181TTCTCAAAAGAAGATGGGGATTTTTGGGACTCCACTGACGAGGGGATTTTGAACAGACCT240||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct181TTCTCAAAAGAAGATGGGGATTTTTGGGACTCCACTGACGAGGGGATTTTGAACAGACCT240Query241TGCTTGCAGGTCAAGAGGCAACTGTATCAGCTCATTGAAGAGGTGACTTTGAGAACCTTT300||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct241TGCTTGCAGGTCAAGAGGCAACTGTATCAGCTCATTGAAGAGGTGACTTTGAGAACCTTT300Query301GAGAAAACCATCTCTACAGTTCCAGAAAAGCAGCTAAGCACTCCTCCCTTGCCCAGAGGT360||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct301GAGAAAACCATCTCTACAGTTCCAGAAAAGCAGCTAAGCACTCCTCCCTTGCCCAGAGGT360Query361AGAAGACCCCAGAGAGTGGCAGCTCACATTACCGGGATCACTCGGAGAAGCAACTTAGCC420||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct361AGAAGACCCCAGAGAGTGGCAGCTCACATTACCGGGATCACTCGGAGAAGCAACTTAGCC420Query421TTAATTCCAATCTCCAAGGATGGAAAGACCTTGGGCCAGAAGATAGAAACCTGGGAGTCC480||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct421TTAATTCCAATCTCCAAGGATGGAAAGACCTTGGGCCAGAAGATAGAAACCTGGGAGTCC48026 Query481TCTCGGAGAGGGCATTCATTTCTCAACCATGTGCACTTGAGAAACGGAGAGCTGGTGATC540||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct481TCTCGGAGAGGGCATTCATTTCTCAACCATGTGCACTTGAGAAACGGAGAGCTGGTGATC540Query541CAGGAGGAGGGCCTGTATTACATCTACTCCCAAACGTACTACCGGTTCAAGGAGGCTAAA600||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct541CAGGAGGAGGGCCTGTATTACATCTACTCCCAAACGTACTACCGGTTCAAGGAGGCTAAA600Query601GAAGCTTCCAAGACAGTCTCGAAGGACGGAGGGAGGATCAAACAGATGGTGCAGTACATC660||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct601GAAGCTTCCAAGACAGTCTCGAAGGACGGAGGGAGGATCAAACAGATGGTGCAGTACATC660Query661TACAAATACACCAGCTACCCCGATCCCATACTGCTGATGAAGAGTGCCAGAAATAGCTGC720||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct661TACAAATACACCAGCTACCCCGATCCCATACTGCTGATGAAGAGTGCCAGAAATAGCTGC720Query721TGGTCCAGAGAAGCTGAGTACGGACTGTACTCCATCTATCAgggggggCTGTTCGAGCTC780||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct721TGGTCCAGAGAAGCTGAGTACGGACTGTACTCCATCTATCAGGGGGGGCTGTTCGAGCTC780Query781AAAGAAAATGACAGGATTTTTGTTTCCGTGACGAATGAGCATTTGATGGACCTGGATCAA840||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct781AAAGAAAATGACAGGATTTTTGTTTCCGTGACGAATGAGCATTTGATGGACCTGGATCAA840Query841GAAGCCAGCTTCTTTGGAGCC861|||||||||||||||||||||Sbjct841GAAGCCAGCTTCTTTGGAGCC8613.PCR鉴定重组克隆阳性转化子大小：1068bp阴性转化子大小：198bp12345678910111227 图-7PCR鉴定电泳图1#：阴性对照（ddH2O）2#：阴性对照3#：阳性对照（GAPDH）4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp5#～12＃Tnfsf10-1～8号转化子4.转染后细胞荧光观察图-8目的质粒转染293T细胞观察200×B28 图-9目的质粒转染293T细胞观察200×G注：200x表示放大倍数；B和G分别表示明视野和荧光视野5.WesternBlot结果Marker1231-阳性2-con3-oE图-10注：Marker：条带大小；阳性：WB标准品—SURVIVIN-3FLAG-GFP(分子大小：48KD)；Con：293T细胞;OE:目的基因质粒转染293T后样品6.滴度荧光照片：29 图-127.滴度检测细胞感染图片：图-13400xB30 图-14400xG根据上述荧光图片中绿色荧光蛋白的表达情况，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到存在2个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒感染了细胞，则该病毒的滴度就应该等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，就是2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl，也就等于2E+8TU/ml。8.Real-timePCR曲线图图-15不同浓度病毒感染后样品组的Ct值及表达量分析样品ActinCt值GFPCt值GFPCt均值31 图-16滴度计算:曲线颜色和样品颜色相同，加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，之后做PCR定量检测，通过比较试验组及control组的Ct值差值来测量病毒滴度的值。一般Ct值差值在2以上则认为存在明显差异。在反转录后得到的20ulcDNA中只用了1ul来检测滴度，所以在计算滴度时就应该乘以20。在本次qPCR滴度检测中，10-4ul组和Con组样品的Ct值相差5，且10-4ul组和10-5ul组样品间Ct值差异不大，故可以认为在10-4ul组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1/(1.00E-04)*20＝2.00E+5TU/ul=2.00E+8TU/ml。讨论人类一直都在不懈地与恶性肿瘤作斗争，但至今这场战役还远没有取得胜利。恶性肿瘤仍然是人类的最可怕的“杀手”。传统疗法效果欠佳，这使得人们必须去探索新的更有效的治疗方法，尤其对医学工作的从业者，这是义不容辞的责任。随着对肿瘤发生、发展的机制的深入研究和生物科32 技的飞速发展，生物治疗逐渐引起人们的广泛关注和积极探索。近些年来，生物治疗尤其是其中基因靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中发挥了重要的作用。寻找有效的的细胞毒性分子诱导肿瘤细胞凋亡逐渐成为治疗恶性肿瘤的研究热点。近十几年来Trail的发现，研究并应用似乎为人们打开了一扇窗。Trail，中文名叫肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，能在人体内大多数正常组织中广泛表达，诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无毒性作用，[1]因此,Trail被认为是一种更为安全且极具潜力的抗肿瘤因子。目前已有研究表明Trail参与机体的免疫自稳、免疫调节及免疫监视,并对病毒感染性疾病、自身免疫性疾病等都有其相应的作用,提示Trail可能具有非常广阔的临床应用前景。[2]1995年Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出Trail基因，1996年[3]Pitti等进一步证实并命名该基因为Apo2L。TRAIL基因定位于染色3q26,cDNA全长1.05kb，相对分子量为32.5KDa、等电点为7.63，是编码281个氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白。本实验使用的大鼠Trail基因，其基因序列号RefSeqID：NM145681.1，其含有861个碱基对。Trail基因定位于染色3q26,cDNA全长1.05kb，相对分子量为32.5KDa、等电点为7.63，它是的Ⅱ型跨膜蛋白可以编码281个氨基酸。Trail受体属于肿瘤坏死因子受体超家族,[4]共有5种受体，包括TrailR1-4和OPG（Osteoprotegerin）,根据功能不同又可分为死亡受体(TrailR1/DR4和TrailR2/DR5)、诱捕受体(TrailR3/DcR1和TrailR4/DcR2)和可溶性受体(OPG)。Trail研究主要成果：在Trail基因治疗方面：如有学者在体外合成腺病毒载体携带Trail，其33 [5][6]能明显抑制神经胶质瘤增值；Jacob用端粒酶启动子在腺病毒载体里表[7]达Trail，其小鼠模型的胰腺癌有强大的抑制作用；Shi等将携带TRAIL的重组腺病毒载体转导入A549细胞，引起肺癌细胞明显凋亡,并在肺癌荷瘤小鼠模型中得到证实。在重组Trail基因蛋白方面：重组的可溶TRAIL有望成为一种抗肿瘤细[8]胞因子。比如：Lawrence等将锌原子和双硫基加入重组TRAIL，该重组TRAIL在有效诱导肿瘤细胞株凋亡，,对人肝细胞的毒性作用却很轻微；[9]Walczak等将异亮氨酸拉链添加进TRAIL重组体,并用其处理带有乳腺癌的荷瘤鼠癌组织,可使肿瘤组织消退。在Trail与其他药物相结合方面，Trail与药物联用在体内实验中亦取得[10]很大进展。Nagane等研究发现Trail与顺铂等化疗药物联合应用具有协同作用。[11]在抗死亡受体蛋白方面，Motoki用Trail-DR5的外功能区免疫小鼠获得DR5的单克隆抗体KMTR2,其对结肠直肠癌细胞均有明显的抑制作。目的基因即为需要研究的基因，如何获得目的DNA片段就成为本研究最基本问题。而目的基因的来源,主要是分离自然存在的基因或者人工合成。常用的方法有直接分离法、化学合成法、cDNA文库筛选法及RT-PCR法。直接分离法是从细胞核中直接分离得到，一般用于简单的原核生物目的基因，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。化学合成法包括磷酸二酯法、磷酸三酯法及亚磷酸三酯法等，该法需要知道目的基因的核苷酸序列，它是分子量较小的目的基因制备方法，其合成的DNA片段一般不超过200bp，故已很少使用。CDNA文库筛选34 法就是从CDNA文库中筛选出包含目的基因的片段克隆，这种方法用原位杂交的方法去筛选阳性的克隆，杂交筛选工作繁琐，效率低。RT-PCR法是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，是目前从组织或细胞中获得目的基因最有效方法。本实验是以吉凯公司提供的已知序列cDNA文库为模板，从含有目的基因的质粒中用PCR法扩增出Trail基因片段。此法高效、方便、快捷。本实验质粒载体检测用的是western-blot法，它采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种半定量检测。目前该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。如果要将外源DNA片段引入到宿主细胞中进行表达或扩增，就需要有一个能够在宿主细胞中进行表达和自我复制的载体来携带。载体有非病毒性和病毒性两种，非病毒载体包括电穿孔、磷酸钙、显微注射、脂质体介导、基因枪法等，转移外源基因效率太低是其最致命的缺陷，从而使这类载体应用受限。而目前应用较广泛的是病毒载体，其基因转移的效率较非病毒载体高很多。病毒载体包括疤疹病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体及慢病毒载体等，但其中有些病毒载体存在许多缺陷，如逆转录病毒载体宿主范围小、感染效率低、只能感染分裂细胞、病毒滴度低及易被灭活等；腺病毒载体不能长期稳定表达目的基因及较易导致免疫反应等等。而慢病毒载体的出现就弥补了这些缺陷和不足，慢病毒(Lentivirus，LV)它不仅能够感染各种分裂缓慢的细胞以及处于分化终末[12]状态的细胞，如神经元和胶质细胞等，而且也可感染各种分裂细胞；其次，慢病毒载体可以携带外源基因并且整合到人靶细胞的基因组中，使特[13]异性的外源基因长期表达；同时慢病毒载体可以容纳较大片段的外源基35 [14]因；另外，慢病毒载体不会引起导致靶细胞死亡的免疫反应；还有，慢病毒载体具有高效介导目的基因整合到宿主细胞基因组和实现目的基因稳[15,16]定表达等特点。本实验使用吉凯基因提供的慢病毒感染目的细胞后不再感染其他细[17]胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。该慢病毒其实是假型病毒，因为其毒性基因已被外源性目的基因所取代。随着慢病毒载体的设计进展，具有较强功能的管家基因启动子，如EF10c、PGK等被引入了载体系统，[18]并实现了在同一载体中表达2个外源基因的功能。这一进展可有助于利用慢病毒载体表达外源基因的同时表达细胞标记基因。在一个真核表达载体系统中，除了具备保证目的基因的转录的一般载体元件外，还应具有其他载体元件如报告基因。其编码的产物是易被检测出的蛋白或酶，故称之为报告基因。目前常用的报告基因有氯霉素乙酞转移酶、荧光素酶、p-葡萄糖普酶、p-半乳糖营酶等。但检测成本较高、检测手段复杂及检测过程费时制约了这些报告基因的广泛应用。绿色荧光蛋白是目前广泛应用的报告基因，它是从水母类动物中分离、纯化出的荧光物质，它能够在不需要外源物质的情况下吸收蓝色光，在真核或原核细胞中表达而发出绿色荧光[20]。该报告基因荧光强度较高，无需底物，在动物细胞中的表达效率较高、[19][20]不会影响融合蛋白活性且可以直接在荧光显微镜下观察。本次实验就是将构建好的质粒载体与慢病毒载体一起共转染293T细胞就能生产出包装好的病毒颗粒。对病毒颗粒滴度检测用到了实时荧光定量PCR技术（RealtimeQuantitativePCR）,RT-qPCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累来实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模36 板进行定量分析的方法。该技术是在常规PCR基础上置入荧光标记，通过荧光探针的观察来测定病毒含量。其基本原理是每经过一个PCR反应循环，收集一次荧光强度信号，通过连续记录荧光强度信号变化值，绘制出荧光扩增曲线图，从而检测产物量的变化。实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。结论本课题将重组质粒与病毒包装辅助质粒共转染包装细胞293T细胞，结果通过荧光显微镜观测到293T细胞中大量绿色荧光蛋白的表达，同时经Western-bloting检测到重组蛋白在293T细胞中的表达，孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2E十8TU/ml。从而证明我们成功建立了Trail重组慢病毒。这为更深入的把有杀灭肿瘤作用的大鼠Trail基因慢病毒载体转导进干细胞提供实验基础参考文献1..范学工.TRAIL受体的T细胞表达[J].免疫学杂志,2000,16(4):316.2.WileySR，SchooleyK，SmolakPJ，eta1．IdentificationandcharacterizationofanewmemberoftheTNFfamilythatinducesapoptosis[J]．Immunity，1995，3(6)：673—682．3.Lai，Z，BradyRO．Genetransferintothecentralnervoussysteminvivousingarecombinantlentivirusvector．[J]NeurosciRes，2002，67：363-371．4.KimY,SColDW.TRAIL,amightyapoptosisinducer[J].MolCells,2003,15:283-293.37 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21.于哲，邢飞跃，王通，等.c-Jun氨基末端激酶在小鼠T细胞增殖中的作用[J].中华微生物学和免疫学杂志,2007,27（3):254－259.英汉缩略词对照表TRAIL肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体PCR聚合酶链式反应dNTP脱氧核糖核苷三磷酸GFP绿色荧光蛋白FBS胎牛血清FITC异硫氰酸荧光素PBS磷酸盐缓冲液ddH2O双蒸水RA维甲酸bFGF碱性成纤维细胞生长因子EGF表皮生长因子PLL多聚赖氨酸Tris三(羟甲基)氨基甲烷PA多聚甲醛NSE神经元特异性烯醇化酶GFAP胶质纤维酸性蛋白Nestin巢蛋白-神经上皮干细胞蛋白DAB3-3-二氨基联苯胺40 TNF肿瘤坏死因子DR死亡受体DcR诱骗受体FADDFas相关蛋白的死亡结构域DED死亡效应器DISC死亡诱导信号复合物致谢历时3月有余，这篇论文在导师的悉心指导下终于完成收稿；我的3年研究生生涯，也随之接近尾声。借此机会，我向所有关心、支持我的老师、同学；领导、同事；朋友以及家人致以诚挚的感谢！并祝愿你们健康快乐！3年研究生生涯在充实的学习、工作中一逛而过，虽然时间不长，但是它成为我作为一名现代医学的实践者，从医学理论到临床实践，再到理论分析这一过程中最具里程碑意义的一段，它实现了我从理论到实践、从实践反馈的理论的升华，使我进一步感悟到现代医学的博大精深，并进一步坚定了为医疗事业奉献毕生的决心和信心。在这期间，我的导师蒋正方教授给予了我系统的教育和精心的指导，无论是在学习方法，还是在学习态度；无论在理论学习，还是临床实践；无论是在实验研究，还是论文写作等方面都对我无私地指导和帮助，让我能够顺利地完成学业，获得学识的提升。特别是蒋教授对待医疗事业认真41 负责的态度，更加是我作为医学晚辈学习的楷模。还记得蒋老师曾说：做医生，就是做良心，就是做人生。他的话我必定谨记于心，并在今后的医疗生涯中不断践行，不断深化；蒋老师亲切的鼓励，也必将激励我在医学生涯中不断前行。还要感谢泸州医学院基础医学院及附属医院神经外科许多专家、教授给予我的理论指导和教学，让我在专业理论方面有了较大的提升。这里不得不感谢的还有绵阳市第三人民医院神经外科吴贵强主任，为了将理论更加紧密地联系实践，吴主任所在的神经外科给我提供了珍贵的实践机会和实践环境，他们的信任和支持给了我极大的鼓励和帮助；吴主任的言传身教也让我亲身感受到一名优秀的医疗工作者所必须具备的素养和职责。这样的经历必将成为我的职业生涯中一笔宝贵的财富。感谢绵阳市第三人民医院神经外科副主任医师刘阳博士在实验设计、具体实验操作以及论文完善过程中给予的细心指导与帮助。还有第三人民医院神经外科曾令勇副主任，徐剑峰、杨华东、高阳、邓李主治医师、张波医师以及科里全体医护人员三年来对我关心及帮助。你们对我学习、工作的点滴帮助我将铭记于心。这3年学习期间，我本人在生活上也完成了人生的传承大事。有人说“男人在当了父亲之后，才真正成为了男人”，也正是这样的蜕变，让我的心智更加成熟，让我在生活中、在工作上更加有担当、更加懂担当。这里，我要对一直支持我的老婆道一声感谢：“你辛苦了！特别是在我学习期间，正是你怀孕、生产、哺育最辛苦的时候，我能顺利完成学业，离不开你无私的付出。”42 最后，感谢参加学位论文评阅和论文答辩的各位专家、教授。我的研究成果迫切期望得到您的肯定和指点。肿瘤坏死因子诱导凋亡配体TRAIL研究现状综述：一摘要:肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumornecrosisfactor,TNFrelatedapoptosisinducingligand,TRAIL）是肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）超家族成员之一,有良好的诱导肿瘤细胞凋亡作用，而对正常细胞无毒性作用,有望成为一种全新的抗肿瘤制剂。本文介绍了其在结构、生理功能、凋亡诱导机制及临床肿瘤治疗应用上的研究进展。关键词:肿瘤坏死因子相关凋亡配体;受体;细胞凋亡;肿瘤治疗肿瘤坏死因家族(TNF)的成员都是广谱抗肿瘤细胞因子，能够诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，并且其抗肿瘤作用可以不依赖于肿瘤细胞的P53基因状态，因此一直是肿瘤治疗研究的热点。肿瘤坏死因子家族有3种分子可诱导凋亡:TNF-α、Fas-L和肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)。TRAIL,又名凋亡素2配体(Apo2ligand,APo-2L)，与前两者比较,不同之处在于:(1)比TNF-α和Fas-L有更广泛的抗肿瘤谱;（2）对NF-κB仅有十分微弱的激活作用,即便是全身用药,也不会像TNF-α和Fas-L那样发生严重的炎症反应;（3）TRAIL具有特异性的和强大的诱导肿瘤细胞凋亡的能力,但对绝大多数正常细胞无此作用。因此,TRAIL被认为是一种更为安全且极具潜力的抗43 肿瘤因子。并且在美国，TRAIL已进入临床Ⅱ期药物开发阶段。1.TRAIL结构及功能TRAIL是TNF超家族成员。1995年Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出TRAIL基因，1996年Pitti等进一步证实并命名该基因为Apo2L。TRAIL基因定位于染色3q26,cDNA全长1.05kb，相对分子量为32.5KDa、等电点为7.63，是编码281个氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白。分为胞内、跨膜，胞外3个部分，N-末端是位于胞内的、没有明显信号肽的14个氨基酸残基，与TNF家族的其他成员无同源性；第15-40位氨基酸为疏水区并形成跨膜结构；C端第41～281位氨基酸为胞外区。保守性较强。在N端第109位的天冬氨酸是一个潜在的N-糖基化位点,可被金属蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶）切下产生114～281氨基酸残基的胞外活性部位，称为可溶性活性肽段，其相对分子质量为24000左右,并可形成分子量为66000左右的三聚体。1个可溶性活性肽段包括4个反向平行的―β‖折叠，形成1个―β‖三明治夹心结构，3个可溶性活性肽段头尾相接形成钟形三聚体，而这种三聚体的形式则是Trail和受体相结合时，发挥活性的功能模式。TRAIL在形成三聚体时生物活性最强,受体激活时也呈三聚体形式,,体外实验表明,全长或可溶形式的TRAIL形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡。近氨基末端裂解点处137～152位氨基酸可以形成一个由12～16个氨基酸残基组成的拉长―AA‖环,此环对TRAIL发挥其细胞毒活性及与其受体的结合起着关键作用。TRAIL在230位存在1个不配对的Cys残基(Cys230)，因此，Cys230对维持TRAIL的空间结构及正常的生物学活性具有决定性作用。TRAIL与其家族其它成员最独特的区别在于其第137-152位氨基酸序列可形成一个由12～44 16个氨基酸组成的拉长凸出的环―AA‖loop，此结构可插入受体的TRAIL结合位点,从而保证受体与TRAIL特异性结合,研究证实,此环对TRAIL发挥其细胞毒活性及与其受体的结合起着关键作用。另外,TRAIL序列中Cys230残基，是一个半胱氨酸残基，它能与二价锌离子螯合,从而使TRAIL形成典型的链夹心三聚体活性结构，半胱氨酸残基和锌离子是维持TRAIL的结构和功能所必需的。Cys230在维持TRAIL的空间结构和生物学活性中具有极其重要作用。若Cys230突变为Ala或Ser,Trail蛋白的稳定性下降,而且不能螯合锌原子形成三聚体,与受体结合能力也会下降200倍,严重影响Trail的诱导凋亡的活性。2.TRAIL受体Trail受体属于肿瘤坏死因子受体超家族,共有5种受体，包括TrailR1-4和OPG（Osteoprotegerin）,根据功能不同又可分为死亡受体(TrailR1/DR4和TrailR2/DR5)、诱捕受体(TrailR3/DcR1和TrailR4/DcR2)和可溶性受体(OPG)。（1）死亡受体(deathreceptor,DR)，DR4和DR5二者均是Ⅰ型跨膜蛋白，在跨膜区后都有一个大小为70个氨基酸的死亡结域,与Trail结合后能将Trail的死亡信息传递至细胞内,引起细胞凋亡。又称为Trail的功能型受体。DR4是由455个氨基酸组成的,其细胞外N端1-13位氨基酸为信号肽,108-206位氨基酸之间含有2个富含cys的重复序列(该重复序列为TRAIL结合位点),227-245位氨基酸为跨膜区。主要表达于脾、外周血淋巴细胞、肝脏、小肠和胸腺；DR5由411个氨基酸组成的,其结构与DR4相似,胞外区高度同源。1-51位氨基酸为信号肽,84-179位氨基酸之间含有2个富含cys的45 重复序列,184-206位氨基酸为跨膜区，主要表达于胎肝、胎肺,成人的外周血淋巴细胞、卵巢、脾、肝、肺等组织。（2）诱骗受体(decoyreceptor,DcR),包括DcR1和DcR2,它们缺乏有功能的胞内死亡结构域,,表现为抑制凋亡,其中DcR1没有胞内死亡结构域,而DcR2仅含有1段大小为24个氨基酸的―截断‖死亡结构域。诱骗受体可与死亡受体竞争结合Trail,诱骗受体由于缺少死亡结构域,与Trail结合后不能诱导细胞凋亡。DcR1由299个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白,其胞外亲水区是以NH2为末端的1-236位氨基酸,，其中1-23位氨基酸为信号肽序列,52-150位氨基酸中含有2个富含Cys的重复序列,其后紧跟5个以15个氨基酸为单位的高糖基化重复序列。该序列可共价结合于GPI(糖基磷脂酸肌醇)的糖链,形成―蛋白-糖-脂肪酸‖复合物。跨膜结合区是237-299位氨基酸。DcR1在正常人组织中表达非常有限。DcR2亦是由386个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白,其胞外功能区与DR4、DR5及DcR1的同源性高达60%左右,但在胞内有一段1/3长度的―截断‖死亡结构域,。DcR2广泛地表达于多种正常组织,而在大多数肿瘤细胞中不表达。（3）可溶性受体(OPG),是一种分泌型糖蛋白,是TNFR超家族的新成员,与诱骗受体一样其胞内也缺少死亡结构域,故也不能诱导细胞凋亡。OPG与破骨细胞分化因子(TRANCE/RANKL)结合后可抑制破骨细胞发生、增加骨骼密度。OPG与DR5的结合位点有相互重叠,而与TRAIL的亲和力比较OPG却要弱很多。体外实验证明OPG有抑制TRAIL诱导细胞凋亡的作用。3.TRAIL诱导凋亡机制TRAIL诱导的细胞凋亡过程是一种跨膜信息传递，包括受体识别、信46 号转导和细胞内效应三个环节。TRAIL与DR4、DR5结合并活化形成三聚体，激活DR4、DR5分子中的死亡结构域，使其死亡结构域相互聚集，并进一步诱导死亡受体胞浆段死亡结构域(DD)与Fas相关蛋白的死亡结构域(Fas-associateddeathdomainprotein，FADD)结合，FADD含有两个相互作用的结构域蛋白，即死亡结构域和死亡效应器(deatheffectordomain，DED)。其中死亡受体胞浆段死亡结构域(DD)与FADD的C端DD结合，而FADD又以其N端死亡效应结构域(DED)与起始因子胱冬酶原（procaspase-8）结合，形成DR4/DR5/FADD/procaspase-8死亡诱导信号复合物(deathinducingsignalingcom-plex,DISC)，促使其中procaspase-8自身催化成有活性的caspase-8。在DISC中被激活的两个pro-caspase-8发生分子内水解，随后二聚化成胱冬酶caspase-8，从而引发了细胞凋亡的流程。被激活的caspase-8通过两条途径启动细胞凋亡。（1）非线粒体依赖途径：活化的csapase8直接激活下游的效应胱天蛋白酶分子caspase-3、caspase-7而启动级联反应，不断地传递和放大凋亡信号，进而引发对TRAIL敏感的细胞出现快速、大量的凋亡；（2）线粒体依赖途径：活化的caspase-8催化Bcl-2家族蛋白Bid(Bcl-2inhibitory、BH3-domain-containingprotein)断裂形成截短的有活性的tBid(trun-catedBid),tBid促使线粒体释放细色素C(cytC)和Smac,cytC、Apaf-1和dATP共同促使procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9,从而活化效应蛋白,最终导致细胞凋亡。细胞凋亡还有一个JNK通路逐渐受到人们的重视。c-Jun氨基末端激酶（NH2-terminalKinase,JNK）是丝裂原活化蛋白激酶超家族成员之一，其在转导并调控细胞凋亡方面具有重要作用。活化的JNK能够与转录因子47 c-Jun和ATF-2的氨基末端处结合，使转录因子的活性部分发生磷酸化，以同二聚体或异二聚体的方式和很多基因启动子上的AP-1及AP-1样位点结合，并激活激活AP-1，促进FasL表达增强，从而导致细胞凋亡。JNK的激活在有些细胞中是促进细胞凋亡，而在另外一些细胞中却相反。另外，凋亡诱导调控核转录因子(NF-κB)的激活能够阻止细胞凋亡,核因子(NF-κB)是在生物体内广存在的一种细胞因子，可参与机体的炎性反应、免疫反应、细胞的增殖和凋亡。NF-κB在TRAIL诱导肿瘤细胞的凋亡过程中所起的作用较复杂，在不同的细胞凋亡中表现出截然不同的作用，有的阻断凋亡，有的却是促进，这种反向调节作用主要由NF-κB两种亚单位的表达水平来决定。NF-κB对于TRAIL诱导细胞凋亡的抑制作用在正常细胞可保护其免受伤害，但在肿瘤细胞却可能产生耐药性。4.Trail在肿瘤治疗中的应用许多研究已经表明,TRAIL能诱导多种肿瘤细胞凋亡,如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、中枢神经系统肿瘤、白血病、胸腺肿瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、黑色素瘤等。裸鼠的体内实验表明,TRAIL对结肠癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤、恶性神经胶质瘤有显著的疗效,而系统毒性非常小。4.1Trail重组蛋白重组的可溶TRAIL有望成为一种抗肿瘤细胞因子,现在已经进入临床研究。TRAIL重组蛋白有很多种形式,主要有sTRAIL41-281、sTRAIL55-281、sTRAIL95-281、sTRAIL114-281及全长TRAIL等,人们为了便于纯化及增加TRAIL活性，在构建重组TRAIL时，会对它进行修饰,如添加His或GST或48 Flag标签或添加亮氨酸拉链等。Pollack等应用重组可溶性TRAIL蛋白治疗颅内种植U87胶质瘤的裸鼠，发现与对照组相比，治疗组出现了明显的生存期延长。而Lawrence等将锌原子和双硫基加入重组TRAIL以增加同源三聚体的稳定性，通过体外试验得到以下结论：该重组TRAIL在诱导肿瘤细胞株凋亡方面有较大的潜能,对人肝细胞的毒性作用却很轻微,将其大剂量长期应用到猴子身上后并不会引起明显的病理变化。Walczak等将异亮氨酸拉链添加进TRAIL重组体,并用其处理带有乳腺癌的荷瘤鼠癌组织,可使肿瘤组织消退,并且出现肿瘤的剂量依赖性生长抑制和肿瘤的清除。杨雷等通过体外实验证明,TRAIL可有效抑制多种肿瘤细胞的生长如：结肠癌细胞、GLC肺癌细胞、人白血病细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞等等,其生长抑制率与Trail剂量呈正相关,且各细胞对TRAIL敏感性不同,其中JurkatT人白血病细胞最为敏感。4.2TRAIL基因治疗研究发现,应用病毒作为载体的基因治疗是治疗肿瘤的一种新策略。载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。利用载体将TRAIL基因转导入肿瘤细胞中,从而诱导肿瘤细胞凋亡。由于病毒载体在表达强度与时空性方面比非病毒载体更优越,因此在基因治疗中受到大家的青睐。目前常用的病毒载体有腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒等。Jacob等研究发现将TRAIL基因与一种用端粒酶启动子纤维修饰过的腺病毒载体重组并转染了5株结肠癌细胞系,导致肿瘤细胞凋亡的显著加强,取得了显著的治疗效果。在颅内胶质瘤的研究中，有学者应用重组的含有分泌型可溶性TRAIL的腺病毒载体(Ad-stTRAIL)进行治疗，结49 果显示Ad-stTRAIL对移植于SCID小鼠大脑的U87-MG神经胶质瘤具有明显的抑制作用,而且没有明显的副作用。Shah等设计了一种单纯疱疹病毒表达质粒(ER-S-TRAIL),该质粒N端融合了Flt3L胞外区并且可以将携带异亮氨酸拉链的重组可溶性TRAIL定向储存在内质网中,然后通过载体(ER-HSV-1-PR)表达的病毒蛋白酶切开内质网与TRAIL之间的肽段,使后者从内质网中释放出来,从而引起凋亡,这种可调控的TRAIL在小鼠模型中的基因表达,还可以被实时近红外荧光探针检测。结果显示,用这种ER-S-TRAIL比未修饰的TRAIL诱导凋亡的效率更高,而且具有很好的旁观者效应,应用前景非常好。Shi等将携带有可溶性TRAIL的重组腺病毒载体rAAV2/5-sTRAIL转导A549细胞引起明显凋亡,在肺癌荷瘤小鼠模型中,不管是局部使用(如瘤内或旁注射),还是全身应用(如静脉或气管内注射),不同途径用药肿瘤生长都被显著抑制,小鼠的存活时间明显延长,同时发现其对体外培养的人原代肝细胞和荷瘤小鼠多个器官均无伤害,证明rAAV2/5-sTRAIL可能成为治疗肺癌的有效方法。5前景与展望肿瘤是世界医学史上久攻不下的难题,至今临床治疗主要还是以手术为主，结合化、放疗的综合治疗方式。TRAIL的发现为其提供了一条新的治疗途径。从TRAIL发现到现在,已经有十多年的历史，，由于TRAIL在大多数的肿瘤细胞中都可以诱导凋亡而对绝大多数正常组织无明显毒副作用，故TRAIL自发现以来就倍受关注。尽管TRAIL有可能具有广阔的临床应用前景，但仍有许多空白领域有待人们进一步探索，TRAIL与其受体功能及信号传导确切途径是什么,为什么正常细胞对TRAIL不敏感？部分肿50 瘤细胞对TRAIL抵抗的具体机制是怎样？是否存在包括细胞死亡的其他途径?TRAIL在免疫系统中的调节起什么作用？阐明这些问题可以帮助我们更深入的了解这个系统。相信随着研究的不断深入和临床试验的开展,将为TRAIL在肿瘤治疗中的临床应用提供更多可靠依据,为人类攻克肿瘤方面提供一种新的方法。参考文献BouralexisS,FindlayDM,EvdokiouA.Deathtothebadguys:targetingcancerviaApo2L/TRAIL[J].Apoptosis,2005,10(1):35-51.范学工.TRAIL受体的T细胞表达[J].免疫学杂志,2000,16(4):316.AnitaC,LingQi,PatrickMulligan,etal.TRAILAgonistsonClinicalTrialsforCancerTherapy:ThePromisesandtheChallenges[J].ReviewsonRecentClinicalTrials(Online).2009,(4):34.WileySR，SchooleyK，SmolakPJ，eta1．IdentificationandcharacterizationofanewmemberoftheTNFfamilythatinducesapoptosis[J]．Immunity，1995，3(6)：673—682．PittiRM，MarstersSA，RuppenS，eta1．InductionofapoptosisbyApo-2ligand，anewmemberofthetumornecrosisfactorcytokinefamily[J]．JBioChem，1996，271(22)：12687一12690．WileySR,SchooleYK,SmolakPJ,etal.IdentificationandcharacterizationofanewmemberoftheTNFfamilythatinducesapoptosis[J].Immunity,1995,51 3:673−682.PittiRM,MarstersSA,RuppenS,etal.InductionofapoptosisbyApo-2ligand,anewmemberofthetumornecrosisfactorcytokinefamily[J].JbioChem,1996,271(22):12687-12690HymowitzSG,O′ConnellMP,UltschMH,etal.Auniquezinc-bindingsiterevealedbyahighresolutionx-raystructureofhomotrimericApo-2L/TRAIL[J].Biochemistry,2000,39(4):633-640WajantH,PfizenmaierK,ScheurichP.TNF-relatedapoptosisinducingligand(TRAIL)anditsreceptorsintumorsurveillanceandcancertherapy[J].Apoptosis,2002,7:449−459.Schulze-OsthoffK,FerrariD,LosM,etal.Apoptosissignalingbydeathreceptors[J].EurJBiol,1998,254(3):4392459.KimY,SColDW.TRAIL,amightyapoptosisinducer[J].MolCells,2003,15:283-293.范开，罗岚，刘洪洪，等.肿瘤坏死因子诱导凋亡配体TRAIL研究进展[J].重庆理工大学学报,2011,25(2):47-52PritzkerLB,ScatenaM,GiachelliCM.Theroleofosteoprotegerinandtumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligandinhumanmicrovascularendothelialcellsurvival.MolBiolCell,2004,15:2834-2841.于哲，邢飞跃，王通，等.c-Jun氨基末端激酶在小鼠T细胞增殖中的作用[J].中华微生物学和免疫学杂志,2007,27（3):254－259.Ruefli-BrasseAA,FrenchDM,DixitVM．Regulationof52 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应用里的最新进展。关键词：慢病毒载体；基因治疗；进展1.载体的构建HIV-1病毒是人类缺陷病原体，大多数慢病毒载体构建均选择HIV-1以确保相应的LV是复制缺陷。最新一代低压技术有几个内置的安全功能，最大限度地减少风险的产生复制能力的人野生型HIV-1重组。通常情况下，LVS所产生的反式互补，使包装细胞共转染包含质粒载体的基因组和包装结构，编码的蛋白质为LV集落和自我失活LV的配置以降低毗邻载体整合位点的编码序列将被取消的内在启动子/增强活动的HIV-1转录失活的可能性[2][3]，病毒也应防止在后续的感染与野生型HIV-1复制能力。因此，如何最大限度地降低载体转染风险水平成问当前的一个主要问题。目前与单LV转染相比，虽然矢量动员技术的风险有所降低，但它的目的基因的获得和载[4][5]体纯度等诸多问题影响其进一步研究。一些研究表明，即使单载体能引起全长度基因转录，但估计有1/3复合载体的基因组将无法转录。究其原因可能是由于内源性复合载体，逆转录生成转录主微管（DS）双链DNA模板[6]较单载体更为复杂。所以，在某些细胞中单链LV的RNA基因组转载成双链DNA的能力可能会限制。例如，LV人类巨噬细胞的转导效率相对较低，这可能是由于限制性核酸内切酶内dNTP浓度影响。此外，逆转录是比较容[7]易出错的，可能会导致出现在LV的基因突变。为提高复合载体转染能力，可提高载体批次滴度，虽然即时转染可以产生高滴度的LV，这种方法对于原代细胞基因组的纯度以及质量要求非常高。为了克服这些限制，更稳定原代细胞系正在开发，现已开发出稳定表达所必需的基本生产病毒载体颗55 粒的病毒基因。然而，由于pol基因编码的慢病毒蛋白酶的内在细胞毒性，[8]所以大量生产很困难。此外，在转载过程中产生的异种包膜蛋白即水泡性口炎病毒G蛋白也是有毒的。为了克服这些局限性，大量研究致力于潜在的毒性蛋白诱导沉默子的表达，以避免这些毒性蛋白表达。2．基因转移的概念和潜在的应用2.1靶细胞和疾病LV转导分裂细胞的能力，使许多不同的基因治疗方法得到长足的发展。以往的研究显示，LV的可作为比较大的转基因腺相关病毒载体，然而，它转载的整体效果并没有其他载体高，因为对于不同的靶细胞和组织，转载效果往往差异很大。稳定转载效率主要取决于靶组织，在体内大多数细[9]胞类型，包括神经元，星形胶质细胞已被证明在可以稳定转载。少突胶质细胞和神经胶质的LV已广泛应用于基因转移到中枢神经系统，并为基因治疗神经系统疾病提供的一定依据。灵长类动物的纹状体和黑质中也发现了类似的LV。然而，这种嗜神经源性的特点，并不是都可以运用于所有细胞中。因此，LV的输入具有同等效率的中枢神经系统的许多不同类型的细胞和传导模式，是由于内部启动子在不同的细胞类型的活动造成的。在运动神经元中，基因治疗运动神经元细胞损伤时使用LV的基因转移到中枢神经系统中是一项很有风险的治疗，因为目前LV还不能广泛地通过血脑屏障[10]。因此，LV的传导基本上仍局限于注射部位的局部区域。相比之下，AAV载体可导致更广泛的传递，并根据血清型，是能够穿越血脑屏障，可能通过持续转基因的表达，也可以通过部分LV的转导实现治疗目的。然而，LV的骨骼肌的传导效率较AAV载体低，而且腺病毒载体不合适作为LV，因为56 大多数的载体基因组不能稳定地整合到靶细胞染色体上。因此，这将导致在治疗目的基因在细胞分裂过程中损伤。全身给药通常在导致广泛的肝细胞损伤和抗原提呈细胞（APC）的激活，包括免疫细胞和脾分泌的γ-片段，而γ-片段不能作为非分裂细胞的载体，但是，LVS可以克服这个限制。此外，AAV2载体与LVS相比，毫不逊色。然而，AAV2需要门静脉注射，而LVS可以全身给药。最近的研究显示AAV8和AAV9较之LV载体，具有更强大的[11]亲和力和兼容性。目前，LVS基因治疗主要集中在帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、肌萎缩性神经退行性疾、先天性失明、肝脏疾病、血友病、代[12]谢性疾病，溶酶体储存障碍等）。LVS适用于各种干/祖细胞的转载，特别是包括造血干细胞（HSCs）稳定表达的转基因治疗相关的水平。然而，这些应用需要高拷贝数，以实现这些表达水平和一些克隆疾病（如血红蛋白病，重症联合免疫缺陷，血友病等）。TThough体外基因治疗是最常用的转导造血干细胞的方法之一，可以克服一些体外基因传递的内在限制。而且，在避免传统原位转导体外培养造血干细胞、祖细胞、甚至成熟的T细胞[13]因归巢能力和功能障碍引发的损伤。2.2基因调控LV对于造血干细胞转导的基因调控是通过许多调控元件提高整体的调控效率来实现的。例如，实现对巨核细胞糖蛋白IIb和珠蛋白启动子的调控，LV通过特定的调控元件作用于红系特异表达基因上游启动子，使其获得更多的转导位点从而以实现高效率的转导。在许多动物模型中这种理论[14]得到反复的。LV转导基因治疗最早运用在临床试验是治疗β-地中海贫血，LV通过调控元件提高整体效能和特异性较高的靶向作用，使得转导以后的57 基因片段达到高效而完整的修复。此外，LV也能通过启动终末分化活跃的启动子/增强子的顺式作用元件，减低转导过程中非分裂的细胞碱基配对中的错位与缺失，降低肿瘤产生的风险。在对于血友病的治疗方面，因LV不能稳定转导核红细胞、血小板以及血小板谱系基因表达，而且不能排除这些谱系基因转导过程中插入致癌的危险基因进而最终导致其恶变。从安全角度出发，基因治疗的方法暂时没有进入临床试验。但是，对于这方面的研究已取得了长足的进展，因为核红细胞和血小板谱系基因的表达始终包含一个原子核的同源基因组。这些谱系共同分泌蛋白质直接进入血液循环。现已证明与LV的造血干细胞的转导可导致红细胞或特定的凝血因子的表达，从而纠正血友病中凝血因子匮乏。这是一个很有风险的血友病基因治[15]疗方法，需要大量高质量的血友病动物模型的建立来反复论证这一结论。LV很容易在体内选择性的转导有效的目的基因最终将受损基因清除，产生有效的血小板内凝血因子的，保护灭活的凝血因子中和抗体。从而构建能够获得强大的系特异性的基因表达，这是目前各种神经退行性疾病治疗的[16]基本原理。目前Wiskott-Aldrich公司正在致力于HSCbased基因治疗和其他造血和溶酶体贮积症治疗的探索。造血干细胞介导的基因转移已被证明[17]是有效的治疗神经退行性疾病，包括异染性脑白质营养不良。此外，药物诱导系统例如，四环素，蜕皮和米非司酮诱导可与LVS一起，以便更好地控制单基因或者复合基因的治疗。但是，这些调控系统过程中也有一些[18]相关的免疫原性物质可增加长期持久性的转基因细胞中的风险。2.3基因治疗中的免疫反应大量基础研究显示，在转染过程中，LV可以触发组织细胞的先天免疫58 [19]和适应性免疫反应。LVS诱导的免疫反应在基因治疗中是一把双刃剑。它可能有助于产生更强大的免疫反应，在基因疫苗制备过程中，这将是一个可能的优势。然而，免疫反应同样可能杀伤目的基因并影响其正常的表达。因此，基因治疗中如何保证稳定的转基因表达而避免产生杀伤性的免[19]疫反应是当前研究的一个重要难题。自限性的炎症反应产生的疾病导致一个短暂的细胞因子的激增如白细胞介素-6和肿瘤坏死因子αβ（IFNαβ）。这种炎症免疫反应，可以归因于LV的粒子的高效转导能力，涉及参与Toll样受体7（TLR7的）模式识别受体的单链RNA（单链RNA）和/或TLR9能够识别甲基化的CpG。值得注意的是，当LV转染能力增加后，肝细胞转导产生大量的IFNβ，并取得了稳定的转基因表达。与腺病毒载体相比，这种先天免疫反应似乎不太可靠。尽管如此，它仍可能影响的载体，转基因的产品和LV的转染细胞的适应性免疫反应。可能会诱发接触到的LV载体的特异性抗体，这将抵消载体颗粒，从而防止随后向量基因转移。许多动物实验试图用启动子/增强子来限制靶组织转基因表达中的杀伤性免疫反应，同[20]时防止异位基因表达过量导致高度的组织特异性的排斥反应。但有学者提出转基因产品的免疫应答不会总是产生―漏‖转基因的效果。为了保护转基因产品的组织特异性表达的和防止基因在APC上的异位表达介导的自身组织杀伤性免疫反应，许多LV中amicroRNA的miR-142-3P纳入监管。这消除了造血干细胞转载中的“脱靶”效应，尤其是APC的表达，可能诱导免[21]疫耐受和目的基因的持续表达。3.成果与展望如今，LV的运用取得了许多可喜的成果。通过LV使得高致病性HIV-159 转换成高效而相对安全的基因传递载体。LV的现在已经成为非常成熟的实[22]验研究载体。临床前的动物模型的建立证明LVS可以治疗甚至治愈疾病。[23]目前有多个LV基因治疗临床试验已被获准。有几个临床试验正在用LVS[24]治疗β-地中海贫血症，醛固酮缺乏，帕金森氏病并取得了长足的进展。至少两个关于LV表达的反义基因对慢性感染艾滋病毒抗病毒治疗方案已[25]被纳入临床治疗方案。单次静脉滴注LV基因修饰的自体的CD4+T细胞的耐受性良好，使得许多HIV患者免疫功能得到改善。LV的造血干细胞介导的基因治疗脱髓鞘疾病日益完善。从患者自体CD34+细胞中取得一部分目的基因，体外用一个LV编码野生型基因加以诱导，然后移植进机体中。短短的24-30个月的随访，重组多克隆粒细胞，单核细胞，T细胞和B淋巴细[26]胞表达超过9-14％。然而，动物低压为基础的基因疗法治疗患同源性人类疾病的模型可以更为有效地反应治疗效果。因此，有必要进行大动物模型的临床前研究，这将是极为重要的评估LV基因疗法特别是因为免疫系统对体内基因治疗与其他病毒载体系统的一个重大的挑战。然而，由于调控频率、免疫反应、假型化等影响LV基因治疗的效果，因此，如何优化LV的结构与功能，加强靶向特异性，提高安全性和效率性成为今后研究中的一[27]个重点。我们有理由相信，随着LV的进一步研究，人类许多基因疾病是可以被治愈的。参考文献[1]May,C,Rivella,S,Callegari,etal.Therapeutichaemoglobinsynthesisinbeta-tha-ssaemicmiceexpressinglentivirus‑encodedhumanbeta-globin[J].60 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构以电子出版物形式出版发行，并对外进行全文内容服务。本人授权泸州医学院可以将本人学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，进行数字化处理汇编、通过网络或其它途径进行交流传播，可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印、扫描或其他复制手段保存和汇编学位论文，即泸州医学院具有本人学位论文的数字化制品复制权、信息网络传播权和汇编权。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》等数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。保密□，在年解密后适用本授权书。本人提交的学位论文属不保密□（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日联系电话：联系电话：65
