鸡pirnas的克隆、表达及体外抑制piwi基因表达的研究

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1、国家自然科学基金项目(No．30700564)资助SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No．30700564)江苏省自然基金(No．BK2009190)资助SupportedbyScienceFoundationofJiangsuProvinceofChina(No．BK2009190)，国家科技支撑计划(2011BAD28803)资助SupportedbytheNationalKeyTechnologyR&DProgram(201BAD28803)鸡piRNAs的克隆、表达及体外抑制Piwi基因表达的研究研

2、究生：张颖IIIIIIIIIIIIUI导师：常国斌副教授Y22587⋯3—5专业：动物遗传育种与繁殖(杨州大学动物科学与桔术学院，江苏杨州225009)摘要piRNAs(Piwi．interactingRNA)是主要富集不同种类动物生殖系中的一类内源性小分子RNA，Piwi基因主要存在于生殖细胞中，在生殖系干细胞的维持和精子发生方面发挥重要作用。生殖细胞中的piRNAs富集现象和导致雄性不育的Piwi突变体中piRNAs的大量减少暗示了piRNAs在配子发育和维持的过程中起重要作用。然而，对于piRNAs的结构共性、起源、表达规律和功能以及与Piwi基因之间的作用机制一直不详。本

3、研究以鸡为模式动物，获得鸡piRNAs序列并系统的探究piRNAs的遗传特性和表达规律：通过构建小RNAs的eDNA文库和T-A克隆测序的方法从睾丸组织中获得了19个大小为23,--,39nt的piRNAs序列；根据piRNAs的大小、同源序列和二级结构特征，选择了3个不同序列并采用Real．TimeqPCR技术分析了中国地方鸡种如皋黄鸡和引进隐性白羽鸡的不同生命阶段不同组织中piRNAs时空表达规律。同时以鸡原始生殖细胞PGCs为实验模型并采用RNAi技术，通过建立Piwi．siRNAs转染PGCs的方法并筛选出最佳沉默序列：采用Lipofectamine‘oM2000脂质体法

4、瞬时转染鸡PGCs，运用Real．TimeqPCR技术检测转染24h、48h和72h后PGCs中Piwi基因、3个与生殖细胞形成和配子发生相关的调控因子(CVH、Dazl、CDH)以及3个调控干细胞多能性及自我更新的转录因子(PouV、Nanog、Sox2)的mRNA水平的相对表达量。为探讨禽类piRNAs的遗传特性及发生和消失的机理提供基础依据，也为禽类小分子RNA及其结合蛋白的深入研究和实际应用积累基础资料。结果表明：1．通过对鸡piRNAs序列特征的研究发现：编码鸡piRNAs基因序列在染色体和基因组中的分布特征同其它物种一样，均具有不均匀性和基因间区偏爱性；二级结构预测，

5、发现鸡piRNAs具有与miRNAs不同的独特的茎．环结构。2．鸡piRNAs多组织表达规律显示：鸡piRNAs不仅大量存在于生殖组织，还大量存在于其它组织，表达规律因piRNAs种类、品种、性别的变化而不同，gga．piR一1在两个品种的公、母鸡的所有组织中的表达量均是相对最低，且到12周龄时均趋向一致的水平；而gga—piR-4表达量相对较高；gga-piR-5在如皋黄鸡雄性中的全部组织中的表达量最高且在8周龄达到最高峰，在隐性白羽公鸡中的表达量相对较高，而在如皋黄鸡、隐性白羽母鸡中均呈现中度表达水平。3．特异性siRNAs抑制实验结果发现：相对于阴性siRNA对照组，3组特

6、异性siRNAs对鸡Piwi表达在不同时间均有不同程度的抑制作用且抑制效果与siRNA序列相对于靶基因的位置和转染时间长短相关，24h后便可检测出明显抑制，48h达到高峰，72h后开始减弱。在3个不同的时间点，空白对照组与阴性对照组相比均无显著性差异(胗0．05)，且3组特异性siRNAs与阴性对照组相比，均具有显著性差异(尸<0．05)。对于3组特异性siRNAs进行比较发现siR．3沉默效率最高。综合以上数据表明，转染48h后的siR．3序列靶向抑制Piwi基因表达效率最高，可用于后续实验的研究。4．Real．TimeqPCR检测CVH、Dazl、CDH及PouV、Nanog

7、、Sox2的相对表达量显示：与阴性对照组相比，抑制Piwi基因表达后，CVH、Dazl和Nanog基因表达量上升，而PouV和Sox2基因表达量下降且差异显著(尸<0．05)。仅CDH基因表达量不变(尸<0．05)。结果表明，PGCs中Piwi基因与CVH、Dazl和Nanog可能负相关，与PouV和Sox2可能呈现正相关，而与CDH可能无明显相关。关键词：piRNAs；鸡；Piwi；PGCs；RNAi；Real．TimeqPCRCloningandexpressionofpiR