免疫组化(ihc)标准化

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1、免疫组化（IHC）标准化                                                                                                                云南省第三人民医院病理科                                                                                                                                             徐开军免疫组化（IHC）是病理诊

2、断的主要辅助手段之一。虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实

3、验室广泛应用。当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。由于免疫组化的固定

4、剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。应避免使用含重金属的固定剂。10%中性缓冲福尔马林配制方法：   40%甲醛        100ml磷酸二氢钠     4g磷酸氢二钠     6.5g蒸馏水         900ml固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。固定时间不宜超过24小时，以防止组织经甲醛过度

5、固定造成的组织抗原损失和抗原活性降低。（2）取材：组织标本的取材厚度一般为0.3cm(不应>0.5cm)，面积一般为（1.0-1.5）cmx(1.0-1.5)cm。（3）脱水：组织在脱水机中的处理需十分恰当，大量的实验室经验公认加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。（4）包埋与切片：组织经过脱水、透明及浸蜡后，进行石蜡包埋。包埋的石蜡过热或温度过高容易导致组织抗原的破坏，尤其对于固定不佳的组织，需选用低熔点的石蜡（熔点<60°C）。（5）切片与展片：切片也是免疫组化染色的重要环节，一般厚度在3-5um之间，淋巴结/淋巴组织和肾穿组织切片应该更薄些

6、。切片要求完整，厚薄均匀，无皱褶无刀痕，太厚会影响免疫组化染色结果和判断，还容易在染色过程中发生脱片。展片可采用二次展片，所谓二次展片：是指在展片过程中，先将组织切片漂浮在30%-40%的酒精溶液中，进行第一次展片，然后将切片捞起放入45-50°C的温水中进行第二次展片。此方法的优点是酒精溶液于水之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱褶的组织切片，但像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织接触酒精后会散开，不建议采用此法。（6）烤片：推荐58-60°C恒温箱烤片2-3小时，但不能进行高温烤片，因为在干燥的条件下加热切片可以加速组织内抗原的氧化而破坏组织中的抗原，使抗原定位不明确。（7）

7、暂不染色切片的保存：进行免疫组化染色最好采用新切片。在实际工作中，蜡块面端可以采用蜡封来避免抗原损失以便长期保存。如果切好暂不染色的切片，应该将切片放置于4°C冰箱短时间保存。（8）脱蜡：免疫组化的脱蜡过程与常规HE脱蜡步骤相同。2、免疫组化抗体的选择、稀释和保存（1）选择：选择抗体应先了解其反应谱和适用条件（包括适用切片<石蜡切片或冰冻切片>、稀释度及温育时间等）。使用一种新抗体时，必须首先摸索出最佳滴度，所谓最佳滴度就是能获得最佳特异反应所需抗原的最低浓度。或者按照有关说明书