藻胆蛋白裂合酶性质及催化功能研究

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1、华中科技大学博士学位论文藻胆蛋白裂合酶性质及催化功能研究姓名：武栋申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：赵开弘20050701摘要藻胆蛋白是存在于蓝藻红藻和隐藻中的一类同源蛋白家族藻胆色素生物合成的最后一步为色素与脱辅基藻胆蛋白的连接体内藻胆色素的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成目前已知藻红蓝蛋白裂合酶PecE/F催化藻蓝色素PCB异构化形成PVB并与脱辅基蛋白PecA连接藻蓝蛋白裂合酶CpcE/F催化藻蓝色素PCB与脱辅基蛋白CpcA的连接PecE/F与CpcE/F之间有20~40%的相似性对这两个酶的催化机理的研究还是空白本研究通过

2、比较两者的氨基酸序列构建缺失突变体定点突变体和使用化学修饰的方法对其功能区域及功能氨基酸残基进行分析首次研究了PecE和PecF催化反应中的辅助因子和酶动力学研究表明巯基2+2+乙醇(5mmol/L)和Mg(5mmol/L)Mn(3mmol/L)是催化反应所必需的1TritonX-100可提高反应效率磷酸钾和Tris混合缓冲液可以提高蛋白的溶解性和减少其对金属离子的的结合有利于催化反应酶动力学研究表明催化反应遵循顺序反应机制在催化反应中PecE主要催化PCB与脱辅基蛋白的连接PecF主要催化色素PCB异构化形成藻紫胆素PVBPCB与脱辅基蛋白PecA

3、在无酶催化下形成共价1连接产物3-Cys-PecA-PCB但不能作为PecE/F的底物被催化形成正确的产物13-Cys-PVB-PecA利用镍离子鳌合亲和层析提纯证明PecE和PecF之间可形成复合物在序列分析和实验室已经研究的PecE/F缺失突变体的基础上构建了缺失突变体PecE(1-267)和PecF(57-212)前者酶活性无变化PecF(57-212)的研究表明PecF中4个独特的连续组氨酸残基对酶活性没有贡献PecE和PecF中4个高同源性的半胱氨酸残基进行了定点突变研究了突变体PecE(C48Q)PecE(C91L)PecE(C161L)

4、和PecF(C122L)在三种不同状态未提纯提纯尿素变性复性下的酶活性酶动力学研究表明PecE的第48位半胱氨酸残基与底物结合有关第91位半胱氨酸残基参与酶催化和底物结合PecF第122位半胱氨酸残基位于酶活性中心对它的突变导致了酶活性丧失PecE和PecF都可以与底物PCB结合半胱氨酸残基的突变导致了PecE突变体结合PCB能力的下降和PecF(C122L)光谱的红移PecE/F与PCB的结合在紫外光激发下显示荧光在尿素变性条件下吸收光谱范围在550~660nm之I间透析以后吸收光谱可以回复到600nmPecE和PecF的缺失突变体和相应的亚基结合

5、实验表明缺失突变体都没有失去形成复合物的能力使用专一性的化学修饰剂对PecE和PecF中功能氨基酸残基进行了研究1,2-环己二酮1,2-cyclohexanedione简称CHD和苯乙二醛phenylglyoxal简称PGO修饰表明两者各有一个精氨酸残基是酶活性必需的焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate简称DEPC)修饰组氨酸残基和N-溴化琥珀酰亚胺(N-bromosuccinimide简称NBS)修饰色氨酸残基使用邹氏作图法表明PecE和PecF各有一个组氨酸残基和色氨酸残基对酶活性是必需的DEPC修饰PecF(57-212)表明

6、PecF的121位组氨酸残基可能是关键氨基酸残基ε-氨基和羧基不是PecE和PecF酶活性的必需基团通过比较CpcE/F和PecE/F的氨基酸序列设计CpcE/F的10个突变体CpcE(42-276)CpcE(1-237)CpcF(21-213)CpcF(1-160)CpcF(10-213)CpcE(1-274)CpcE(L276D)CpcE(1-272)CpcE(L275D)CpcF(I9K)CpcF(21-213)和CpcE(1-237)失去酶催化活性CpcF(1-160)折叠发生错误在尿素复性时恢复部分酶活性并且可与CpcE结合酶动力学研究显示

7、CpcE(L275D)和CpcF(I9K)可能与底物结合有关CpcE/F与PecE/F之间的交叉重组研究表明CpcE和PecF可催化生成相对活性为6的a-PECCpcF和PecE则不能催化此反应对CpcE和CpcF进行化学修饰证明CpcE中各有一个精氨酸残基和色氨酸残基是必需基团CpcF中一个羧基为必需基团CpcE和CpcF的催化可能遵循酸碱催化的机制重组体系中不需要使用还原剂CpcE和CpcF可以与藻蓝色素PCB结合结合有利于减少PCB与脱辅基蛋白自发连接形成副产物结合于CpcE或CpcF或者CpcEF上的PCB可以转移到脱辅基蛋白CpcA上形成正

8、确的产物结合在裂合酶上的PCB在紫外灯的照射下发出橙红色的荧光通过与已知PCB含量的天然CPC荧光强度比较定