减少副产物合成及过量表达ARO10对酿酒酵母异丁醇产量影响的研究

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1、分类号：_____密级：_____________UDC：____编号：_____________河北工业大学硕士学位论文减少副产物合成及过量表达ARO10对酿酒酵母异丁醇产量影响的研究论文作者：高玉菡学生类别：全日制学科门类：工科学科专业：生物工程指导教师：胡滨职称：副教授张爱利副教授孙延宁高工资助基金项目：国家自然科学基金。NO.21206028；高等学校博士学科点专项科研基金。NO.20121317120014；河北省自然科学基金。NO.B2013202288；河北省教育厅高等学校科学技术研究项目。NO.q2012024；河北工业大学优秀青年科技创新基金

2、项目。NO.2012009。IDissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiochemicalEngineeringREDUCEBY-PRODUCTSYNTHESISANDUSINGDIRECTIONALCELLULARLOCALIZATIONOFKEYENZYMESTOIMPROVEISOBUTANOLPRODUCTIONINSaccharomycescerevisiaeByGaoYuhanSupervisor:AssociateProf.HuBinAssoci

3、ateProf.ZhangAiliMay2016Foundationitem:ThisworksupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina.No.21206028.DoctoralFundofMinistryofEducation.No.20121317120014.TheHebeiProvinceNaturalScienceFund.No.B2013202288.TheHebeiProvincialOfficeofEducationScienceandTechnologyResearchProje

4、cts.No.q2012024.TheHebeiUniversityofTechnologyOutstandingYouthScienceandTechnologyInnovationFund.No.2012009.IIIII摘要异丁醇作为新一代生物燃料，与传统生物燃料乙醇相比，具有能量密度高、挥发性小、吸湿性低、辛烷值高等优点。异丁醇还可与石油、汽油以任意比混溶，再加上其生产工艺与乙醇相似，现有的乙醇生产设施经过稍微改造便可以生产异丁醇，因此异丁醇的市场潜力较为巨大。能代谢产异丁醇的微生物有许多，但只有酿酒酵母本身具有合成异丁醇的优势基因，能在自然条件下利用

5、自身缬氨酸代谢实现异丁醇的生物合成；并且对异丁醇毒性的耐受高达20g/L及以上；再加上酿酒酵母可以利用木质纤维素发酵产异丁醇，可大大降低发酵成本，使其成为研究高产异丁醇的首选菌株。利用生物合成法发酵生产可再生能源异丁醇，是目前市场及研究者都极为重视的方法。本工作以酿酒酵母W303–1A(实验室保藏)为原始菌株，利用基因工程以及分子生物学知识构建高产异丁醇菌株。主要工作有如下几方面：第一，基因GPD1、GPD2和LPD1的质粒的构建；第二，利用一步基因置换法缺失基因GPD2和GPD1以降低副产物甘油的合成；第三，利用一步基因置换法缺失基因PDC6以降低乙醇的合成

6、；第四，过量表达编码乙酰乳酸合酶的ILV2基因，并在线粒体里过量表达编码酮异戊酸脱氢酶的ARO10基因；第五，对ILV2基因和ARO10基因表达量做RT-PCR验证；第六，检测所构建工程菌的发酵性能。工程菌HZAL–13(PGK1p–BAT2gpd2Δ::RYUR)是在实验室前期工作基础上在菌株HZAL–2中缺失GPD2基因得到；工程菌HZAL–14(PGK1p–BAT2pdc6Δ::Rgpd2Δ::RYUR)是在HZAL–13基础上缺失PDC6基因得到；工程菌HZAl–18(PGK1p–BAT2pdc6::RΔgpd2Δ::Rgpd1Δ::RYUR)是在HZ

7、AL–7基础上缺失GPD1基因得到；W303–1A(PGK1p–ILV2PGK1p–ARO10)是在W303–1A里过表达基因ILV2和ARO10得到的。本工作研究结果表明：对照菌株W303–1A，工程菌HZAL–13pILV2以及工程菌HZAL–14pILV2，异丁醇最大产量分别为0.0298g/L，0.1623g/L和0.3093g/L。工程菌HZAL–13pILV2的异丁醇产量比对照菌株增加4.45倍；工程菌HZAL–14pILV2，异丁醇产量较对照菌株增加9.38倍；工程菌W303–1ApILV2pARO10的异丁醇产量最大值达到0.1193g/L，其

8、产量较对照菌株增加2.87倍。综上所述