hpv经wnt通路致宫颈癌上皮-间质转化的研究

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1、目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4研究论文HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮间质转化的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31讨论⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．34结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39综述Wnt信号通路与妇科肿瘤上皮间质转化的研究进展⋯⋯⋯⋯43致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53中文摘要HPV经Wnt通路致宫颈癌上皮一间质转化的研究摘要目的：本实验通过分别构建针对HPVl6E6、E7和HPVl8E6、E7的microRNA(miRNA)干扰载体并转

3、染HPVl6阳性的宫颈癌细胞株SiHa和HPVl8阳性的HeLa细胞，抑制癌基因E6、E7的表达，观察E6、E7基因沉默对上皮．间质转化(epithelial—mesenchymaltransition，EMT)的相关基因——p—catenin、E—cadherin和N。cadherin和Wnt／13一cmemn信号通路表达的影响，分析肿V与宫颈癌细胞发生EMT的相关性，阐明HPV导致宫颈细胞发生EMT的可能信号通路机制，为以HPV为靶点的宫颈癌的基因治疗提供系统的理论依据。方法：1．培养HPVl6阳性的人宫颈癌细胞株SiH

4、a和HPVl8阳性的人宫颈癌细胞株HeLa。2．miRNA干扰质粒的构建及质粒提取：分别构建针对HPVl6E6、HPVl6E7、HPVl8E6、HPVl8E7的miRNA干扰质粒，以及1个阴性对照microRNA干扰质粒。分别中提各质粒以用于瞬时和稳定转染过程。3．瞬时转染和转染效率的测定：利用脂质体转染技术分别转染人宫颈癌细胞株SiHa和HeLa，瞬时转染48小时后通过倒置荧光显微镜观察细胞并计数，计算转染效率。4．稳定转染：构建的干扰载体含对杀稻瘟菌素的抗性，故分别用不同浓度的杀稻瘟菌素作用于宫颈癌细胞SiHa和HeLa

5、，确定宫颈癌细胞SiHa和HeLa的筛选浓度及维持浓度；进而建立相应的稳定转染的细胞。5．实时定量PCR(Real．TimePCR)技术检测各组靶基因的干扰效率：分别以SiHa和HeLa细胞为阴性对照，检测各干扰质粒和阴性对照质粒转染宫颈癌细胞后对各自靶基因HPVl6E6和E7、HPVl8E6和E7mRNA表达的影响，计算各自的干扰效率，筛选出干扰效率最高的质粒用于后续实验。6．EMT相关基因的检测：为进一步研究HPV与宫颈癌EMT的相关机制，利用Real—TimePCR技术，检测HPV被干扰前后Wml、13-catenin

6、、E．cadherin及N—cadherin的表达情况，分别以未转染的SiHa和HeLa细胞中文摘要为阴性对照。结果：1．倒置相差显微镜观察人宫颈癌细胞株SiHa和HeLa均生长旺盛，细胞形态呈现多样化。2．倒置荧光显微镜观察和计数用各干扰质粒及阴性对照质粒瞬时转染48小时后荧光阳性细胞占所有细胞的比例，转染效率可达70．80％。3．干扰效率的检测：针对SiHa细胞系，以未转染的SiHa细胞为阴性对照，各组分别以各自的GAPDH为内参照，Real—TimePCR技术检测发现转染干扰质粒HPVl6E6一miRNA后，HPVl6

7、E6rnRNA的表达量较SiHa细胞组降低，对HPVl6E6的干扰效率达77．8％，而经HPVl6E7．miRNA2、I--IPVl6E7一miRNA4转染后HPVl6E7mRNA的表达量较SiHa细胞组降低，对HPVl6E7的干扰效率分别为67．3％和59．4％，可见卸W16E7一miRNA2具有更高的干扰效率。而转染阴性对照质粒(Neg-miRNA)组与SiHa细胞相比，HPVl6E6和E7mRNA的表达均无明显变化fP>0．05)，说明阴性对照质粒不影响。SiHa细胞HPVl6E6和E7mRNA的表达。针对HeLa细胞

8、系，以未转染的HeLa细胞为阴性对照，以GAPDH为内参照，Real．TimePCR检测示转染I-IPVl8E6一miRNA后，I--IPVl8E6rnRNA的表达量较HeLa细胞组降低，对HPVl8E6rnRNA的干扰效率达87．3％，而经HPVl8E7一miRNAl、HPVl8E7．m