水稻实验rna组学：snorna大规模筛选及结构与功能分析

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1、中山大学博士学位论文水稻实验RNA组学：snoRNA的大规模筛选及结构与功能分析姓名：卓敏申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：屈良鹄20040604卓敏水稻实验RNA组学：moReA的大规模筛选及结构与功能分析中山大学博士学位论文2004摘要非编码RNA(ncRNA)是一类具有重要生物功能的核酸调控分子，目前已鉴定的ncRNA数量及种类有限，因此继续分离和鉴定新的ncRNA并阐明其功能是当前RNA组学研究的国际前沿。核仁小分子RNA(snoRNA)是细胞核内ncRNA的重要组成部分，主要包括两类：boxC／DsnoRNA和boxH／ACAsnoRNA。近

2、几年的研究表明，snoRNA的结构、功能以及基因组织均呈现高度多样性，snoRNA除了在核糖体的生物合成中具有重要作用之外，很可能还具有其它重要的生物功能。早期研究指出植物比酵母和哺乳动物具有更多的转录后修饰，因此植物中应存在大量与rRNA修饰相关的snoRNA。目前在单子叶模式植物水稻中仅报道了十余种boxC／DsnoRNA和两种boxH／ACAsnoRNA，大量水稻snoRNA有待发现和鉴定。采用各种方法继续鉴定新的水稻snoRNA，对于阐明植物snoRNA的结构与功能，基因组织与表达特点具有重要意义，而且为最终揭示snoRNA乃至ncRNA在细胞新陈代谢中的作用提供

3、了新的依据。本论文采用本实验室建立的一种新的实验RNA组学方法一锚定引物法，以水稻幼芽为研究材料，分别运用oligodT引物和特异引物CDdTl6与ACAdTl6构建了3个不同的cDNA文库。测序分析表明，采用特异引物构建文库可以使某一类SDORNA相对富集；文库中含有高丰度的rRNA克隆，需采用有效的筛选技术，才能提高测序效率。在本实验室创建的PCR产物点阵膜杂交筛选技术的基础上，对其在植物cDNA文库筛选中的应用条件进行了优化，筛选后测序结果表明，snoRNA以及ncRNA候选序列的溅出比例大大提高，而rRNA的测出比例明显降低，说明本论文中采用的杂交筛选技术可有效筛

4、出文库中的重复克隆，使测序效率得到明显改善。经大规模的文库筛选和测序分析，在水稻中共获得38种boxC／DsnoRNA和28种boxH／ACAsnoRNA，与目前已鉴定的水稻snoRNA比较，除了U3、U14等9种boxC／DsnoRNA和snoR2、snoR5这两种boxH／ACAsnoRNA之外，其它29种boxC／DsnoRNA和26种boxH／ACAsnoRNA均为首次在水稻中发现。此外，在cDNA文库中还发现了大批ncRNA候选序列，其中很可能含有目前未知的ncRNA。研究结果表明，构建富集snoRNA的cDNA文库是发现和鉴定snoRNA新种类的有效途径，同时

5、也能发现部分新的ncRNA。对29种新的boxC／DsnoRNA的功能进行分析表明，20种具有指导rRNA特定位点修饰的功能，它们共指导了5．8S、18S和25SrRNA中29个位点的甲基化修饰；其余9种缺乏与rRNA或者snRNA配对的反义序列，是boxC／DsnoRNA的新类型，其功能有待进一步确定。序列及功能的同源性比较分析表明，29种新的boxC／OsnoRNA中，7种广泛存在于植物、酵母或哺乳动物中；9种boxC／DsnoRNA为植物特有；其余13种仅在水稻中发现。对已鉴定的3&种水稻boxC／DsnoRNA的基因组织进行分析表明，27种分别位于2S个不同的sn

6、oRNA基因簇，其中8个位于蛋白质基因内含子中。此外，snoRl75单独位于RNA结合蛋白基因的内含子中；snoRl27紧邻tRNA-Met的下游，在tRNA启动子的作用下与tRNA一同转录，这是一种新的snoRNA基因组织形式。在snoRNA基医簇中，另发现了15种新的水稻boxC／DsnoRNA，其中U27尤为突出，它既指导18SA28位的甲基化，也指导U6A43位的甲基化，目前在植物中尚无指导两种不同RNA修饰的snoRNA的报道。水稻18srRNA甲基化位点系统鉴定实验中，共确定了39个2’一。一核糖甲基卓敏水稻实验RNA组学：snoRNA的大规模筛选及结构与功能

7、分析中山大学博士学位论文2004化修饰核苷，由以上boxC／DsnoRNA指导的25个位于18SrRNA中的甲基化修饰核苷得到了实验验证。其中U61指导的Cm744，snoRl32指导的Am799为水稻18SrRNA特有的27一o-核糖甲基化核苷；snoRl21和snoRl78推测指导的功能经实验证实不存在，因而它们可能具有其它功能。根据boxH／ACAsnoRNA的结构与功能关系推算，26种新的水稻boxH／ACAsnoRNA中，21种指导rRNA的转录后修饰，aca070指导U4snRNA的假尿嘧啶化修饰，而aca073推