sars冠状病毒rna依赖rna聚合酶原核和真核表达及纯化论文

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1、北京协和医学院;中国医学科学院硕士学位论文SARS冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶原核和真核表达及纯化姓名：张蕾申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：刘力20090501北京协和医学院硕士学位论文中文摘要2002年11月至2003年6月，在全球20多个国家和地区爆发的严重的急性呼吸道综合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome，SARS)是由一种新型的冠状病毒(coronavirus，CoV)弓l起的。SARS病毒是全基因组flj29，727个核苷酸组成，具有11个开放阅读框，基因组结构与其它冠状病毒相似，基因序列与原先发现的冠状病

2、毒的同源性不高，被列为冠状病毒科的新类型。其编码的蛋白质推测有23种，但对感染患病起重要作用的可能是5种关键蛋白：E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、蛋白酶复合体，蛋白酶复合体分成14个蛋白，其中包括RNA依赖的RNA聚合酶(RNADependemRNAPolymemse，RDRP)。SARS病毒的蛋白酶复合体编码区占基因组序列长度的2／3，相应的转录产物在翻译时利用特有的核糖体移框(ribosomalflameshiffing)机制产生两个大小不同的ORFlab和ORFlb编码框编码木瓜水解蛋白酶(papain-likeproteinase，PLPpro)和3C样

3、胰凝乳酶(3C．1ikeproteinase，3CLpro)，二者可自身水解消化成16个成熟的复制酶蛋白(亦非结构蛋白，nonstrucaualprote毗nsp)。通过一系列生物信息学BLAST比对，在此16个非结构蛋白中发现RNA依赖性聚合酶(RDRP，nspl2)存在高度保守的稳定结构域，并且几乎所有的正链RNA病毒都编码有RNA依赖的RNA聚合酶，其中GDD基序高度保守的，可能与酶的催化功能相关。冠状病毒复制酶蛋白的合成是病毒在细胞中生命活动的开始，复制酶蛋白复合体及其水解产物对于病毒基因组的复制、亚基因组的转录以及翻译后的调节起到重要作用，而目前这种分

4、子机制仍不清晰。本课题包括的研究内容有：1)首先利用两对引物从SARS．CoVeDNA扩增出RDRP基因的全长，分别克隆入真核表达载体pCMV-Myc和原核表达载体pGEX4Tol。2)真核表达RDRP蛋白并研究其细胞定位。3)原核诱导GST-RDRP融合蛋白，并纯化此蛋白，为了进一步研究RDRP蛋白的功能做准备。4)利用PCR定点突变技术将GDD突变为ADD，即将甘氨酸突变为丙氨酸，并构建突变ADD的真核和原核表达载体pCMV—Myc．M．PolandpGEX．4T-1．M．Pol。5)原核诱导突变型GST-RDRP融合蛋白，并纯化此蛋白，为下一步比较野生型和

5、突变型GST-RDRP体外合成RNA的功能作准备。本实验中，通过pCMV-Myc．Pol转染293细胞，用Western．blot方法检测到其2北京协和医学院硕士学位论文成功表达，并在共聚焦显微镜下观察蛋白在293细胞的定位；通过构建pGEX4T01．Pol和pGEX4T-I．M．Pol，在大肠杆菌中成功地诱导了带有GST标签的野生型和突变型重组蛋白，诱导表达后纯化得到野生型和突变型GST-RDRP重组蛋白。结论：成功构建的真核表达载体，在真核细胞中过表达的RDRP蛋白主要定位在细胞质。成功构建表达突变型和野生型RDRP融合蛋白的原核表达载体，在大肠杆菌内高效表

6、达，纯化后得到分子量约为116kDa的野生型和突变型GST-RDRP融合蛋白，为进一步探讨RDRP的功能奠定基础。关键词：RNA依赖的RNA聚合酶；原核表达；真核表达；定点突变；蛋白纯化3北京协和医学院硕士学位论文AbstractTheexpressionandpurificationofSARS—CoVRNADependentRNAPolymeraseTheSevereAcuteRespiratorySyndrome(SARS)whichspreadmorethantwentycountriesfromNov．2002toJune2003wascausedby

7、anovelcoronavirus，calledSARS·CoV．Thecompletegcnomesizeis29，727bp．PhylogeneticstudyindicatesthatSARS-CoVmaystandupastheforthgroupofcoronavirus．111emainviralproteinsareS，E，M，N，3CL，andRDRP．Coronavirusreplicationincellsisinitiatedbytranslationofthetwooverlappingopenreadingframes(ORFlaand

8、ORFlb)ofther