math5对大鼠视网膜müller细胞源性干细胞向神经节细胞转化的调控作用

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1、中图分类号UDCR77610八年制学位论文学校代码!Q§三3密级公珏Math5对大鼠视网膜Mtiller细胞源性干细胞向神经节细胞转化的调控作用RegulationofMath5onretinalMfiller．-derivedstemcellsdifferentiatingintoretinalganglioncells作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：张雪咏临床医学眼科学湘雅医学院夏晓波教授论文答辩日期趁＆：监：芭答辩委员会主席中南大学2013年5月原创性声明本人声明，所呈

2、交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：越日期：五吐L年丛月丛日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或

3、部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。⋯名：燧新签殛馅期：垃年幽盐日摘要第一章大鼠视网膜Mtiller细胞的原代培养及纯化目的：对大鼠视网膜MOiler细胞进行原代培养并改良其纯化方法，以得到高纯度的Mtiller细胞。方法：取出生10．21天SD大鼠，显微镜下分离视网膜，经胰酶消化后置于含10％FBS的DMEM培养基中培养，6．8天后换液，将视网膜细胞分为A、B两组，A组行完

4、全胰酶消化法传代培养，B组行反复不完全胰酶消化法传代培养。观察两组细胞的生长情况，培养一个月后行免疫荧光组织化学检测、荧光激活流式细胞分选仪(FACS)及RT．PCR对两组细胞进行检测，比较两组视网膜Mtiller细胞的纯度。结果：细胞培养一个月后，FACS分析显示，A组获得视网膜Mtiller细胞的纯度为75．41％，而B组获得视网膜Mtiller细胞的纯度高达98．01％。RT．PCR结果显示B组中视网膜Mtiller细胞的表达物(GS、Vimentin、Clusterin、Carbonican

5、hydrase)高于A组；而视网膜其他细胞的标志物B组无表达，A组少量表达。荧光显微镜10倍下各组分别选取lO个非重叠视野，计算表达GS的细胞阳性率。A组GS阳性表达率为83．20％4-5．16％，B组GS的阳性表达率为98．50％4-1．08％，采用两样本近似t检验统计学分析，t一9．178，P<0．005，两种方法差异有统计学意义。结论：相对于完全胰酶消化传代法，反复不完全胰酶消化传代法更易获得高纯度的Mtiller细胞，且纯化后的细胞具有形态规则、分布均匀等特点。第二章视网膜干细胞的培养及鉴定

6、目的：通过体外去分化诱导，将视网膜Mtiller细胞培养成视网膜干细胞，并进行鉴定。方法：取用反复不完全胰酶消化传代法培养一个月第3代的视网膜Mtiller细胞，在去分化培养基(含lxN2，2xB27，20ng／mlEGF，10ng／mlbFGF)中培养，诱导去分化。通过在倒置相差显微镜下观察细胞成团形态，免疫细胞化学反应、RT．PCR、Westerblot检测视网膜干细胞特异性表达产物Pax6和Nestin的表达；Edu染色检测细胞增殖能力。结果：去分化培养3．7天，细胞聚集成球表现出神经干细胞特

7、性，传2．3代后仍表现出较强的增殖能力。免疫荧光细胞化学检测显示，神经球中Pax6的阳性率为92．94％+6．48％，Nestin的阳性率85．96％+6．04％：RT．PCR及Westernblot显示，神经球大量表达Pax6和Nestin相关mRNA及蛋白产物。Edu染色显示神经球内细胞具有增殖能力。结论：鼠MUller细胞在去分化培养基中能去分化为具有自我更新和增殖能力的视网膜神经干细胞。II第三章Math5对视网膜干细胞向神经节细胞分化的调控目的：探讨Math5基因转染视网膜干细胞后对其向神

8、经节细胞分化的调控作用。方法：体外培养视网膜Mtiller细胞，将高纯度的视网膜Mtiller细胞去分化培养为视网膜干细胞；构建PGC．FU．Math5．GFP慢病毒，将细胞分组：PGC．FU．Math5．GFP慢病毒转染组、PGC．FU．GFP空载体转染组及未转染组。用倒置相差显微镜每天观察转染后的视网膜干细胞，转染后置于分化培养基(DMEM／F12，lng／mLBDNF，luMRA，I％FBS)中继续培养，7天后采用免疫荧光化学检测神经节细胞特异性标志物Bm3b并