布鲁氏菌介导的宿主小泛素化及抗凋亡机制的研究

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1、分类号：密级：学号：2010108045单位代码：10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌介导的宿主小泛素化及抗凋亡机制的研究学位申请人监通陈创夫教授指导教师张辉副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学专业研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月Thestudythechangeofsmallubiquitin-relatedmodifierandantiapoptoticmechanismsincellswithBrucellainfectingADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInP

2、artialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAgricultureByJianTong(animalsNutrition)DissertationSupervisor:Prof.ChenchangfuProf.ZhanghuiJune,2013III中文摘要类泛素化修饰主要是参与细胞周期调控、信号传导、转录调控、细胞凋亡、细胞增殖与分化、蛋白转运、DNA修复以及应激反应等多种细胞功能调控。目前，有关类泛素对细菌介导的细胞生物进程变化研究较少。布鲁氏菌是一种典型的兼性胞内菌,寄生在宿主巨噬细胞内复制繁殖，对宿主细胞功能有

3、很大的影响。因此，研究布鲁氏菌介导对细胞内类泛素的变化与布鲁氏菌引起凋亡的影响具有重要意义。本研究主要包括以下几方面：1.鼠源类泛素蛋白SUMO1/2/3的原核表达、纯化及抗体的制备经鉴定、测序成功构建原核表达载体pET-SUMO1/2/3。将其在大肠杆菌中表达，可见相对分子质量约为30KD的蛋白带，而且在6h时表达量最高。用蛋白纯化系统纯化类泛素融合蛋白，免疫兔子，制备多克隆抗体血清经Western-blot分析表明表达的蛋白具良好的反应原性。2.布鲁氏菌介导对细胞类泛素表达影响的研究布鲁氏菌M5-90和16M菌株分别侵染巨噬细胞后，通过免疫印迹方法和荧光实时定量方法分别检测细胞中类

4、泛素SUMO1蛋白表达水平与SUMO1/2/3mRNA转录水平。结果显示：布鲁氏菌M5-90和16M菌株侵染巨噬细胞后，SUMO1蛋白水平与mRNA转录水平在12h内都是呈现先上升后下降的趋势，M5-90侵染组SUMO1表达量在4h时最高（p<0.01），而16M侵染组在8h时表达量最高（p<0.01）；在布鲁氏菌侵染巨噬细胞时细胞中SUMO2mRNA水平呈现先上升后下降的趋势，M5-90侵染组SUMO2mRNA水平在4h和8h要明显高于对照组与16M侵染组（p<0.01）；SUMO3mRNA水平在16M侵染时要显著高于对照组和M5-90组，M5-90组8h时高于对照组（p<0.05）

5、，而在12h时低于对照组。3.类泛素SUMO1真核表达载体的构建及对布鲁氏菌胞内生存与细胞凋亡的影响成功构建真核表达载体pcDNA-SUMO1。通过荧光实时定量方法测定pcDNA-SUMO1质粒在巨噬细胞中最佳转染条件；通过瞬时转染重组质粒pcDNA-SUMO1使SUMO1在细胞中过量表达，用布鲁氏菌侵染巨噬细胞后，用LgCFU方法检测SUMO1对布鲁氏菌胞内存活和细胞凋亡的影响，结果显示：转染pcDNA-SUMO1质粒组的胞内M5-90菌数量在12h内呈现下降趋势，4h后转染pcDNA-SUMO1质粒的胞内菌数显著低于对照组（p<0.05），转染pcDNA-SUMO1质粒的胞内16M

6、菌数量在4h后呈现上升趋势，显著低于对照组（p<0.05）；SUMO1在细胞中过量表达，用布鲁氏菌侵染巨噬细胞，用流式细胞术检测SUMO1对布鲁氏菌介导的凋亡的影响，结果显示：布鲁氏菌侵染巨噬细胞后，各组细胞凋亡率都呈现上升趋势，转染pcDNA空质粒组与对照组差异不显著，转染pcDNA-SUMO1质粒组的细胞凋亡率明显高于对照组（p<0.05）。以上研究结果表明：制备兔抗SUMO1/2/3蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性；布鲁氏菌在侵染细胞时能够引起SUMO1蛋白表达与SUMO1/2/3mRNA转录水平的变III化，类泛素对于布鲁氏菌在宿主细胞中存活和细胞抗菌都起着一定的作用；在pcD

7、NA-SUMO1质粒转染巨噬细胞，可以提高细胞中SUMO1表达量，SUMO1能降低细胞中布鲁氏菌的数量，抑制布鲁氏菌在宿主中的存活，而且能提高布鲁氏菌引起的凋亡，从而抑制布鲁氏菌在细胞中的繁殖。这为研究SUMO1对布鲁氏菌哪些效应蛋白起作用奠定了基础。关键词：类泛素；布鲁氏菌；巨噬细胞；凋亡IVAbstractSumoylationismainlyinvolvedinmanykindsofcellfunction,suchascellcycle