猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制及其pcv2抗体竞争elisa检测方法的建立与初步应用

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1、猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制及其PCV2抗体竞争ELISA检测方法的建立与初步应用DevelopmentofMonoclonalAntibodiesagainstPCV2andthepotentialapplicationcompetitiveELISAforPCV2antibodydetermination研究生：苏相亭专业：预防兽医学导师：高崧教授刘秀梵教授扬州大学兽医学院2013年6月苏相亭：猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制及其PCV2抗体竞争ELISA检测方法的建立与初步应用三猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制及其PCV2抗体竞

2、争ELISA检测方法的建立与初步应用研究生：苏相亭导师：高崧教授刘秀梵教授摘要fIllllllllllllU』1111IIlUlUlIlllIY2419071猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型引起的以猪的体质下降、腹泻、消瘦、呼吸困难为特征的一种传染病。猪是圆环病毒的主要宿主。猪对圆环病毒有较强的易感性，各种年龄的猪均可感染，可导致猪的免疫抑制。猪圆环病毒在全球范围内对生猪的养殖业造成了巨大的经济损失，快速、准确地诊断猪群的抗体水平对防治本病具有重要的意义。本研究将PCV2Cap蛋白的去核定位信号肽基因插入原核表达载体pET-32aqb

3、，经IPTG诱导表达，产生了具有免疫原性的融合蛋白。经过表达条件的优化，表达的蛋白仍以包涵体形式存在。经尿素变性、透析复性、Ni柱纯化后的蛋白作为免疫原，免疫6-8周龄的BALB／c小鼠，细胞融合、间接ELISA筛选、亚克隆后获得3E7、3C7、5A7、6D6等4株能够稳定分泌针对PCV2Cap蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，其上清效价分别为1：1280、1：1280、l：25605Ⅱ1：10240，腹水效价分别为1：12800、l：102400、1：12800和1：204800，其中3C7不仅与PCV2具有荧光反应，而且对本室构建的

4、PCVl．2具有荧光反应性，其上清和腹水的荧光效价分别为1：80和1：3200，4株单抗亚类均为IgM。以表达并且纯化后的融合蛋白作为包被抗原，并根据4株单抗的特性，挑选出单抗3C7作为竞争一抗建立了检钡fJPCV2抗体的竞争ELISA方法。经过血清稀释度、封闭液、竞争时间等条件的优化，最终建立了特异性好、灵敏度高的竞争ELISA方法，并利用该方法对猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等病毒抗体进行检测，结果均无交叉反应。用该方法检测了猪血清189份，结果表明：该方法检测结果与商品化的PCV2ELISA抗体检测试剂盒符合率为93．7％，阳性和阴

5、性符合率分别为94．9％和87．9％；与间接免疫荧光的符合率为85．2％，阳性和阴性符合率分别为87．4％和76．3％。我们建立的间接竞争ELISA方法具有简单、快速、灵敏度高等特点，可以被广泛用于扬州大学硕士学位论文2———————————————————————————————————————————————————————————————一-一__一PCV2血清抗体水平的检测。关键词：猪圆环病毒2型；单克隆抗体；间接ELISA；竞争ELISA苏相亭：猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制及其PCV2抗体竞争ELISA检测方法的建立与初

6、步应用三DevelopmentofmonoclonalantibodiesagainstPCV2andthepotentialapplicationofcompetitiveELlSAforPCV2antibodydeterminationM．S．candidate：SuXiangtingAdvisor：Prof．GaoSongProf．LiuXiufanAbstractTheprocinecircovirusdiseasewiththecharacteristicofphysicaldeterioration，diarrhea，w

7、eightloss，difficultbreathingiscausedbyprocinecircovirustype2(PCV2)．Pigsarethemainhostofprocinecircovirus．PigshavestrongsusceptibilitytoPCV2，pigsofallagescallbeinfected，resultinimmunosuppressed．PCV2hascausedhugeeconomiclossestothepigindustryworldwide，andhowCanwediagnosi

8、spigsantibodylevelsfastandaccuratelyhasbecameanimportantstepforpreventionandtreatmentofthisdisease．Inthisstudy,thegen