dna免疫制备抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的研究

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________DNA免疫制备抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的研究姓名：伍婧茹学号：2111543009院系：基础学院学位类型：学术学位专业：病原生物学研究方向：病原生物学的致病作用及防治研究导师：张文军副教授论文提交日期：2018年03月27日论文答辩日期：2018年05月22日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文Preparationofanti-H.pyloriyolkantibodybyDNAimmuni

2、zationCandidate：WuJingruStudentID：2111543009Affiliation：SchoolofBasicCoursesAcademicDegreeApliedfor：MasterofBasicMedicineSpeciality：PathogenicBiologyandimmunologySupervisor：Prof.ZhangWenjunAssistantSupervisor：DayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPha

3、rmaceuticalUniversityMay2018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，系我个人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已特别加以标注和致谢的地方外，不包含其它个人或机构已经发表或撰写过的研究成果。对本研究做出贡献的其它个人和集体，均已在文中明确说明和致谢。本人充分意识到本声明的法律结果完全由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文使用授权的声明本人完全了解广东药科大学有关保留和使用学位论文的规定，学校有权保留和向有关部门或机构送交本论文的复印

4、件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印或其它复印手段保存和汇编本学位论文。保密论文在解密后适用本声明。论文作者签名：论文导师签名：日期：年月日广东药科大学硕士研究生学位论文DNA免疫制备抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体的研究摘要幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp.)在全球有较高的感染率，是唯一种能在胃酸环境下定植的病原菌。H.pylori的定植改变了胃部的酸性环境，并释放毒性物质，诱发一系列慢性甚至恶性胃部疾病。卵黄免疫球蛋白（Eggyolkimmunoglo

5、bulin,IgY）可以由特异性受体激发，在鸟类的B淋巴细胞内产生经由血清运送到卵黄当中的天然抗体，IgY可以通过产生被动免疫保护作用对由病原菌、病毒等引发的人畜疾病起到治疗效果。目的选取H.pylori免疫原性强的致病因子黏附素（HpaA）、尿素酶B亚基（UreB）、I亚基（UreI）克隆至真核表达载体。再将克隆的真核表达重组质粒作为抗原，免疫蛋鸡生产制备特异性卵黄抗体（IgY）后检验其生物学活性。为研究与开发针对幽门螺杆菌的预防性保健食品和临床诊断试剂及治疗奠定基础。方法与结果利用PCR技术分别将H.pylori的HpaA、UreB

6、、UreI基因进行扩增，通过双酶切法将目的基因分别克隆至pET28a(+)和pCMV-tag2B两种质粒上。再分别将重组的质粒转化（或转染）至蛋白表达工程菌和真核细胞中进行目的蛋白的表达；得到具有活性的目的蛋白，经凝胶层析法初步纯化后，通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白的表达情况以及表达量的大小。结果显示，真核表达与原核表达的蛋白都有良好的特异性免疫反应，说明重组的真核表达质粒具备进行活体免疫的可行性。制备去除内毒素的三种真核表达重组质粒，用pCMV-tag2B-HpaA、pCMV-tag2B-UreB、pCMV-

7、tag2B-UreI以及三种质粒的等比混合物分别免疫蛋鸡，并将纯化后的HpaA、UreB、I广东药科大学硕士研究生学位论文UreI三种蛋白抗原作为对照组一同进行免疫。收集鸡蛋，水稀释法结合PEG沉淀后再利用DEAE-SephoroseFastFlow凝胶过滤柱层析纯化后，测定抗H.pylori的特异性卵黄抗体（Hp.-IgY）的生物学活性，Westernblot结果各组Hp.-IgY都能与相应的抗原发生特异性结合，有良好的免疫反应性；间接ELISA结果显示DNA免疫蛋鸡所产生的特异性IgY的效价能达到与蛋白抗原免疫蛋鸡所产生的特异性Ig

8、Y效价水平；凝集实验显示Hp.-IgY与H.pylori能在体外发生凝集沉淀。结论本课题通过以上实验论证了构建HpaA、UreB、UreI基因疫苗的可行性，并通过DNA免疫获得了与传统免疫方式效价接近的特异