致犊牛肺炎和关节炎牛支原体诊断方法的建立

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1、分类号：密级：学号：2010108050单位代码：10759石河子大学硕士学位论文致犊牛肺炎和关节炎牛支原体诊断方法的建立学位申请人金云云指导教师剡根强教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月IEstablishmentofMycoplasmabovisInducingPneumoniaandArthritisofCalfDiagnosticMethodsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPa

2、rtialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByJinYun-yun(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.YanGen-qiangJune,2013II摘要III牛支原体（Mycoplasmabovis，M.bovis）是一种可导致牛发生肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流产与不孕等多种疾病的重要致病性病原体，在环境等其他应激因素的作用下还可引起多种疾病

3、的继发感染。自1961年Hale在美国首次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原后，其他国家也相继发现并暴发了由该病原引起的牛支原体病，我国自2008年开始以湖北省为首的不同地区也相继暴发了牛支原体疫情，目前该病在世界范围内广泛存在，发病率和死亡率较高，每年因该病给世界养牛业带来的经济损失巨大，严重影响和制约着各国养牛业的发展。因此，建立快速准确的检测方法对于该病的诊断和防治有重要意义。本研究在牛支原体新疆分离株分离鉴定完成的基础上，分别从病原学、血清学及分子生物学角度出发建立了三种不同的快速检测方法，以期更加全面、准确地对该病作出诊断。本论

4、文的研究结论如下：1.M.bovis间接免疫酶标组织化学方法的建立。分别以鸡抗M.bovisIgY、羊抗鸡IgG-HRP为一抗和二抗，对牛支原体菌体涂片、牛支原体阳性肺组织切片进行免疫组化染色，通过条件优化，建立了M.bovis间接免疫组化检测方法，用该方法对病死犊牛病料进行检测，并以细菌分离培养和PCR方法进行验证，检测结果与分离培养和PCR结果一致，具有特异性和可靠性。2.M.bovis间接ELISA检测方法的建立。以M.bovis全菌体蛋白经超声波裂解后的裂解物作为包被用抗原，通过棋盘滴定法确定抗原的最适包被浓度为200ug/m

5、L，待检血清最佳稀释度为1:100，同时对抗原的包被方式、酶标二抗最佳工作浓度、一抗和二抗最佳作用时间等进行了优化，建立了检测M.bovis血清抗体的间接ELISA方法，用该方法检测牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻粘膜病抗血清均无交叉反应，表明该间接ELISA具有很好的特异性。3.基于牛支原体P81基因环介导等温扩增方法的建立及与巢式PCR灵敏度的比较。根据GeneBank中登录的M.bovisP81基因序列设计特异性引物，通过条件优化，建立了M.bovis环介导等温扩增（LAMP）检测方法。将该方法的灵敏度与巢式PCR进行对比，并用其检测

6、牛支原体外的其他几种病原菌，同时对疑似感染M.bovis的临床病料进行检测。该方法的灵敏度比巢式PCR高103倍，最低检出限为1.1fg/uL，对其他几种病原菌的检测结果均为阴性，临床病料检测结果与分离培养符合率为100%。关键词：牛支原体；诊断方法；免疫组化；间接ELISA；LAMP研究类型：B（应用研究）AbstractMycoplasmabovis(M.bovis)isanimportantpathogenicpathogens,itcancausebovineIVpneumonia,arthritis,mastitis,cor

7、nealconjunctivitis,earinfections,reproductivetractinflammationandevenmiscarriageandinfertility.Itcanalsocauseavarietyofdiseasessecondaryinfectionundertheenvironmentandotherstressfactors.Since1961HaleisolatedthispathogenfrommastitismilkforthefirsttimeintheUnitedStates,ot

8、hercountrieshavealsofoundandbrokenoutMycoplasmabovisdiseasecausedbythispathogen.IndifferentregionsofChina,ledb