鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验性研究，1■1●T●J●'_·-●●●．1患ItUnlesonlS0latlonandcuIturationInvitroandtransplantationinvivoofmurineFetalLiverstemcells课题来源：国家973重点基础研究发展计划(2010CB945502)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院王亚萍佟明华主任内科学临床专业型硕士研究生研究生学院2013年5月广州硕士学位论文鼠胎肝干细胞的体外分离培养及体内移植的实验

2、性研究背景硕士研究生：王亚萍指导教师：佟明华主任摘要第一章一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，存在于许多组织中；根据其发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。肝干细胞(hepaticstemcell，HSC)是成体干细胞的一种，可分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞。跟据其起源的不同，可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞，前者主要包括肝卵圆细胞、小肝细胞，后者主要起源于骨髓干细胞和胚胎干细胞。目前研究肝干细胞已成为世界范围的热点，由于它具有来源广泛、增殖能力强、移植细胞体积小等

3、传统肝细胞无可比拟的优点，可以预测它将替代肝脏移植和肝细胞移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源。正是由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势，因此探讨如何获得高纯度的肝干细胞及其特异性的标志物有重要的现实意义。正常情况下，体内肝干细胞多处于静息期，数量极少，分离时常先经药物或手术造成肝脏损伤，肝脏灌流或联合细胞分离液分离来获得肝干细胞，操作复杂且成本较高。相比较传统的肝干细胞分离培养方法而言，本实验室首次采用先机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞，简单的离心分离法和胰蛋白酶选择性消化法相结合，从孕15天大鼠胎肝组织中成功分离出

4、肝干细胞。此方法在原中文摘要代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs，且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点，为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。目的改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法，提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法1、购清洁级别近交系孕15天SD大鼠，利用械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞，后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进行进一步的纯化，得到较为纯化的肝干细胞。加入含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。2、将卵圆细胞接种于预先用0．2％明胶处理的盖玻片上置于2

5、4孔培养板中，37。C，5％C02孵箱培养24小时，至细胞长成单层后行免疫荧光化学检测。细胞消化传代，对P10代细胞进行免疫组织化学检测。分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物CD34、C．Kit、OV6、CKl9的表达情况结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁，5d后细胞体积增大，呈梭形或多边形。经1～2次差异性消化传代后，细胞呈集落样生长，边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝于细胞C．Kit、甲胎蛋I刍(AFP)抗原、OV6、细胞角蛋I刍(CK)19呈阳性表达，不表达ALB。P10代肝干细胞C．Kit

6、、CKl9、OV-6及CD34呈阳性表达。结论此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs，且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点，为深入研究肝干细胞生物学特性和进行体内移植实验提供了物质基础。关键词肝干细胞细胞分离纯化鉴定免疫细胞化学硕士学位论文第二章大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用背景长期以来，成熟肝细胞和卵圆细胞在损伤肝的再生中如何发挥作用一直是肝干细胞研究领域的核心问题，对两者在损伤肝再生中的作用也有着不同的观点。一方面，有报道认为部分肝切除(partialhepatectomy，PH)后

7、大鼠肝可在二周内再生并恢复至原来大小，有人连续进行了12次PH后发现仍能完成肝再生：这种肝再生多被认为是单独由成熟肝细胞分裂增殖完成的。另一方面，在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区d,N管和Hering’S管的卵圆细胞(ovc)被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞。目前，为研究成体肝脏中肝干细胞的增殖、分化，研究者们采用各种不同的方法抑制肝细胞增殖，并采用药物(如CCl4)或肝部分切除术等诱导肝脏急性损伤，以激活肝脏干细胞。从而研究肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。本研究鉴于RS是公认的能长期抑制成

8、熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂，而PH又能给予强烈的肝再生需求，我们建立了肝脏切除及其联合应用倒千里光碱导致肝脏急性损伤的大鼠模型，通过对Rs／PH和1／3PH后肝再生过程中成熟肝细胞和卵圆细胞的比较病理学研