寄主植物对甜菜夜蛾核型多角体病毒感染宿主的影响.pdf

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学校代码：10264研究生学号：M150110168上海海洋大学硕士学位论文寄主植物对甜菜夜蛾核型多角体题目：病毒感染宿主的影响EffectofHostPlantsontheInfectionofSpodopteraexigua英文题目：MultipleNucleopolyhedrovirus(SeMNPV)toHostLarvae专业：生物学研究方向：昆虫生理生化姓名：郭玲指导教师：蒋杰贤二O一八年五月二十四日 I 上海海洋大学博/硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李家乐上海海洋大学教授主席张德福上海农科院畜牧所研究员委员李震上海农科院畜牧所研究员委员刘惠莉上海农科院畜牧所研究员委员郑洪建上海农科院林果所研究员委员范晓芬上海市农业科学院助理研究员答辩秘书上海农科院华漕院区2018年5月答辩地点答辩日期机关大楼二楼会议室25日II 本研究得到国家自然科学基金面上项目《寄主植物对甜菜夜蛾核型多角体病毒感染宿主的影响和机理》(编号31672083)的资助III 寄主植物对甜菜夜蛾核型多角体病毒感染宿主的影响摘要探索植物、植食性昆虫和昆虫病毒之间的相互作用关系，是生态学和昆虫学关注的焦点之一。本文以“寄主植物、甜菜夜蛾、核型多角体病毒”为研究目标，着重探讨以下几个问题：1）植物化学物质对病毒致死昆虫的影响；2）植物如何影响病毒感染夜蛾中肠组织、围食膜结构及中肠基因的表达量。主要结果如下：1.为探明寄主植物对病毒感染宿主的生态学效应，用叶碟法测试了取食3种植物和人工饲料（对照）的昆虫对病毒的易感性，并统计分析取食不同食物的幼虫感染病毒后的病亡情况。结果显示：食物资源、病毒剂量以及两者的交互效应，显著影响幼虫病亡率和幸存时间，幼虫病亡率随幸存时间的延长而降低；病毒经蕹菜感染幼虫后半致死剂量最高（1222.4OBs/幼虫），而在黄豆上的半致死剂量与人工饲料的无显著差异，分别为110.5、107.6OBs/幼虫。指数模型模拟结果表明：病毒对幼虫的半致死剂量，随叶片中总酚含量和过氧化物酶活性的升高而升高，而随其他4种酶活性值的升高而降低。本研究揭示，取食黄豆后，病毒对昆虫的致病力最强，而取食蕹菜后，这种致病力最弱；植物叶片中总酚和过氧化物酶抑制病毒对甜菜夜蛾的致病力，而过氧IV 化氢酶、超氧化物歧化酶、内切几丁质酶和外切几丁质酶增强这种致病力。2.为阐明寄主植物对病毒感染宿主的生理效应，利用体式显微镜观察甜菜夜蛾感毒前后围食膜在不同时间点的变化，以及采用石蜡切片法探究取食不同寄主植物和人工饲料的中肠组织病理变化。结果表明：无论取食何种食物，感毒后的围食膜，由无色透明、具有弹性的圆桶状结构，变成乳白色、弹性降低的单片状结构，且围食膜受损坏程度随感毒后时间的推移而加重，最后变成无弹性的碎片；取食人工饲料和黄豆的幼虫，病毒对其中肠组织的破坏程度最大，而甘蓝次之、蕹菜最小。该部分研究认为，寄主植物能够影响病毒破坏宿主中肠组织。3.为进一步验证寄主植物对病毒感染宿主的生理效应，分别剖取了取食3种植物和人工饲料的甜菜夜蛾幼虫感毒前后的围食膜，通过电镜扫描进一步观察了不同处理的围食膜超微结构。结果表明：在7个观察时间点（感毒后1、2、3、6、12、24、48h），取食饲料的幼虫，在感毒后1h时，围食膜有孔洞出现，2h时，围食膜恢复且未被发现孔洞，从3h开始，围食膜又被逐渐破坏；取食黄豆的幼虫，在感毒后1、2h时，围食膜破坏依次加重，而在3h时，其被破坏的程度降低，在感毒后6-12h内，这种破坏程度又逐渐加重；取食甘蓝的幼虫，在感毒后前3h内，感毒幼虫围食膜破坏程度加大，6h时减弱，感毒后12h时，围食膜破坏又加重；取食蕹菜的幼虫，感毒后前6h内，围食膜破坏程度V 逐渐加重，12h时减弱，24h时破坏程度又加重。此外，还发现感毒后24、48h时，取食饲料的感毒幼虫围食膜孔洞最大，取食黄豆、甘蓝和蕹菜的依次减弱；病毒经饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜感染幼虫后，幼虫围食膜出现孔洞的时间点分别为感毒后第1、2、2、3h，修复时间点分别在2、3、6、12h。由此可见，寄主植物能够引起感毒宿主围食膜结构不同程度的变化。4.为揭示病毒影响宿主的分子效应，构建了48h感毒（48hD）和48h未感毒（48hW）甜菜夜蛾中肠转录组，利用IlluminaHiSeq测7序平台，获取了感毒和未感毒幼虫CleanReads分别为4.346×10、74.248×10条，占RawReads的98.65、98.66%；获得74,066条unigene，有3,265条unigene被共同注释到NR、GO、KEGG、EggNOG和Swissprot等5种数据库。有11,584条注释到GO分类，参与到免疫过程的unigene有243条。5,526条unigene注释到KEGG，在KEGG代谢中参与细胞生长与死亡和免疫系统的基因序列分别为214和195条。经过基因表达差异分析发现，甜菜夜蛾幼虫感毒前后有1785个unigene表达量存在差异，其中上调、下调基因数分别为935、850个。5.取食饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的甜菜夜蛾在感毒后4h和12h时，黄豆组甜菜夜蛾肠黏蛋白（SeIM）基因的表达量显著高于其他3组，甜菜夜蛾几丁质酶（SeCS）基因在感毒后4h时表达量未出现显著性差异；感毒后12h时，饲料组SeIM基因的表达量显著高于甘蓝组和蕹菜组，饲料组SeCS基因的表达量显著高于其他3组；24h时，VI 饲料组和黄豆组SeIM、SeCS基因的表达量均显著低于甘蓝组和蕹菜组；48h时，甘蓝组和蕹菜组SeCS表达量显著高于其他2组。本研究立足于“植物、昆虫和病毒”三者之间的关系，解析不同植物对病毒感染宿主的影响。研究结果显示，寄主植物可以调控病毒对昆虫的致病力，这种致病力的差异能指导农业生产实践，可以高效利用昆虫病毒防治不同作物上的害虫。此外，本研究发现了不同植物能引起核型多角体病毒感染甜菜夜蛾幼虫中肠组织、围食膜结构以及基因表达量的差异，该类结论丰富了植物利用昆虫病毒协同防御植食性昆虫的生理与分子机制研究。关键词：甜菜夜蛾，核型多角体病毒，寄主植物，围食膜，中肠组织，转录组测序，基因表达量分析VII EffectofHostPlantsontheInfectionofSpodopteraexiguaMultipleNucleopolyhedrovirus(SeMNPV)toHostLarvaeABSTRACTTheinteractionsamongplants,herbivoresandinsectvirusesareoneofthefocusinecologyandentomology.Weusedhostplants,beetarmywormandSeMNPVastheresearchobjects,todiscussfollowingissues:1)effectsofphytochemicalsonviruslethalinsects;2)howplantsregulatetheeffectsofthevirusinfectiononthestructureofmidgutandperitrophicmembrane,andtheamountofmidgutgenesexpression.Themainresultsareasfollows:1.Toexploretheecologicaleffectofplantsoninsect-virusinteractions,thesusceptibilityof3speciesofplantandartificialfeed(control)totheviruswastestedbytheleafdiscmethod,andthediseaseanddeathofthelarvaeinfectedwithdifferentfoodresourceswereanalyzed.Theresultsshowedthatthefoodresources,thedoseofvirusandtheirinteractioneffectsignificantlyaffectedthemortalityandsurvivaltime,andthemortalityoflarvaedecreasedwiththeprolongationofsurvivaltime;infectedlarvaefeedingonIpomoeaaquaticaleaveshavetheLD50(1222.4VIII OBs/larvae),andtheonesfeedingonGlycinemaxandartificialdietswere110.5,107.6OBs/larvaebothofwhichhavenodifferentsignificance.TheresultsofexponentialmodelsimulationshowedthattheLD50increasedwiththeincreaseoftotalphenolcontentandperoxidase(POD)activityinleaves,butdecreasedwiththevaluesoftheother4enzymeactivity.ThisstudyrevealsthatafterfeedingGlycinemax,virusdiseaseofSpodopteraexiguaisstrongestandafterfeedingIpomoeaaquaticaistheweakest;Totalphenolandperoxidaseintheinhibitionofplantleafvirusdiseaseofbeetarmyworm,andcatalase(CAT),superoxidedismutase(SOD),endochitinase,andexo-chitinaseincreaseit.2.Toelucidatethephysiologicaleffectsofhostplantsonvirus-infectedhost,thechangesofperitrophicmembrane(PM)inSpodopteraexiguaatdifferenttimepointswereobservedbyasanamicroscope.Andweusedparaffinsectioningtechnologytoinvestigatethepathologicalchangesinthemidguttissues,whichfeedon3plantsandartificialfeeds.TheresultsshowedthatthestructureofPMofinfectedlarvaefeedingonanyfoodwaschangedfromtransparentandflexiblycylindricalstructuretoopalescentandsheet-likestructurewithreducedelasticity,thedegreeofdamageofthePMincreasedwiththeincreaseofvirustreatmenttime.Whenthelarvaewereinfected,thedestroyofvirustothemidgutwasgreatestonartificialdietsorGlycinemax,thefollowingIX wasBrassicaoleraceaandtheleastdamagewasonIpomoeaaquatica.Thisstudysuggeststhathostplantscanaffectvirusdestroythemidguttissues.3.Tofurthertestifythephysiologicaleffectsofhostplantsonvirus-infectedhost,weextractedthePMofbeetarmywormlarvaefeedingon3plantsandartificialdiets,observedtheultrastructureofPMbyusingelectronmicroscopescanning,andselected7observationtimepoints(exposuretimeof1,2,3,6,12,24and48hafterNPVtreatment).TheresultsindicatedthatthePMoftheinfectedlarvaefeedingonartificialdietsappearedtobeholeson1haftertreatment,recovered(noholes)on2h,andweredestroyedgraduallyfrom3haftertreatment;thePMofinfectedlarvaefeedingonGlycinemaxwasgraduallydestroyedfrom1to2haftertreatment,thedegreeofdestructionisreducedon3h,andwerealsodestroyedgraduallyfromhour6to12aftertreatment;afterthelarvaefedonBrassicaoleracea,thePMoftheinfectedlarvaewasdamagedgraduallyinthefirst3h,and6hwasdecreased,butthisdamagewasaggravatedgraduallyfrom12h;afterthelarvaefedonIpomoeaaquatica,thePMoftheinfectedlarvaewasdamagedgraduallyinthefirst6h,12hwasdecreased,and24hbecomeserious.Inaddition,itwasalsofoundthat24hand48hafterinfection,thePMholesoffeedingartificialdietswerethelargest,andtheorderofeatingGlycinemax,BrassicaoleraceaandX Ipomoeaaquaticaweakened.Aftertheinfectionoflarvabyfeedingartificialdiets,Glycinemax,BrassicaoleraceaandIpomoeaaquatica,thetimepointsfortheholesappearingonthePMofthelarvaewere1,2,2and3h,andrecoveredwas2,3,6,12h.Thus,weconcludedthathostplantscouldregulatetheeffectsonthePMofinfectedlarvae.4.Torevealthemoleculareffectsofhostplantsonvirus-infectedhost,weconstructed48hD(virus-infected)and48hW(non-infected)transcriptomelibrariesofbeetarmyworm,usingtheIlluminaHiSeqsequencingplatformhaveaccesstotheCleanReadsof48hDand48hW77were4.346x10and4.248x10,accountingfor98.65and98.66%oftheRawReads.Wegot74066unigenes,ofwhich3265unigenessharedannotationwith5databases,includingNR,GO,KEGG,EggNOGandSwissprot.Therewere11584unigenesannotatetoGO,andthe243unigenesparticipatedintheimmunesystemprocess.The5526unigeneswereannotatedbyKEGG,participatedinthegenesequencesofcellgrowthanddeath,andtheimmunesysteminKEGGmetabolismwere214and195respectively.Throughdifferentialgeneexpressionanalysis,wefoundthattherewere1785differetiallyexpressedgenes(DEGs)between48hDand48hW,andthenumberofup-regulatedanddown-regulatedgeneswere935and850respectively.5.Spodopteraexiguafeedingonartificialdiets,Glycinemax,XI BrassicaoleraceaandIpomoeaaquaticawereat4hand12hafterbeinginfected,theexpressionofSpodopteraexiguainsectintestinalmucin(SeIM)geneintheGlycinemaxgroupwassignificantlyhigherthanthatintheother3groups,whiletherewerenosignificantdifferenceintheexpressionlevelofSpodopteraexiguachitinase(SeCS)at4hafterbeinginfected.After12h,theexpressionlevelofSeIMfeedingartificialdietswassignificantlyhigherthanthatinBrassicaoleraceaandIpomoeaaquaticagroups,andtheexpressionlevelofSeCSfeedingartificialdietswassignificantlyhigherthanother3groups.After24h,theexpressionlevelsofSeIMandSeCSfeedingartificialdietsandGlycinemaxweresignificantlylowerthanthoseinBrassicaoleraceaandIpomoeaaquaticagroups.After48h,theexpressionlevelofSeCSfeedingBrassicaoleraceaandIpomoeaaquaticagroupsweresignificantlyhigherthanthatoftheother2groups.Basedonthetritrophicinteractionsofplants,beetarmywormandSeMNPV,weexpoundedtheplant-mediatedeffectsoftheinfectivityofSeMNPVtobeetarmyworm.TheseresultsconcludedthathostplantscouldregulatetheinfectivityofSeMNPVtobeetarmyworm,andthatthisdifferenceofinfectivityondifferentplantscouldguidethepracticeofagriculturalproduction,whichhasagreatsignificancefortheeffectiveuseofinsectvirusestocontrolpestsondifferentcrops.Inaddition,thisstudyfoundthattheSeMNPVinfectionhasthepotentialtoalterthemidgutandXII PMstructure,andthegeneexpression.Theseconclusionswillenrichthephysiologicalandmolecularmechanismsthatplantcooperatedwithinsectvirustodefendagainstinsectherbivores.Keywords:Beetarmyworm(Spodopteraexigua),nucleopolyhedrovirus,hostplants,peritrophicmembrane,midguttissue,transcriptome,geneexpressionanalysisXIII 目录第一章引言..............................................................................................................11.1研究目的及意义................................................................................................11.2文献综述：寄主植物对昆虫病毒感染宿主的影响........................................11.2.1寄主植物对昆虫病毒感染宿主的生态学效应......................................21.2.2寄主植物对昆虫病毒感染宿主的生理生化与分子机制......................21.2.3研究手段：转录组学研究进展..............................................................61.3本研究技术路线图............................................................................................8第二章植物化学物质调控核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫的致病力..................92.1实验材料............................................................................................................92.2试剂与器材......................................................................................................102.3实验方法..........................................................................................................102.3.1试虫感毒处理........................................................................................102.3.2总酚含量.................................................................................................112.3.3过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性.............................112.3.4几丁质酶活性........................................................................................122.4数据处理..........................................................................................................132.5结果与分析......................................................................................................142.5.1校正死亡率和幸存时间........................................................................142.5.2半致死剂量和半数致死时间................................................................182.5.3叶片化学物质含量比较........................................................................192.5.4半致死剂量/半数致死时间与叶片化学物质含量关系.......................202.6讨论..................................................................................................................22第三章取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后中肠组织的变化243.1实验材料..........................................................................................................243.2试剂与器材......................................................................................................243.3试验方法..........................................................................................................243.3.1试虫感毒处理........................................................................................243.3.2核型多角体病毒对甜菜夜蛾围食膜的影响........................................243.3.3甜菜夜蛾中肠组织石蜡切片的制备与染色........................................253.4结果与分析......................................................................................................26XIV 3.4.1核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫围食膜的影响................................263.4.2核型多角体病毒对取食不同食物甜菜夜蛾中肠组织的影响............273.5讨论..................................................................................................................31第四章取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后围食膜超微结构的变化................................................................................................................................334.1实验材料..........................................................................................................334.2试剂与器材......................................................................................................334.3试验方法..........................................................................................................334.3.1试虫感毒处理........................................................................................334.3.2取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染病毒后围食膜超微结构的观察334.4实验结果..........................................................................................................344.5讨论..................................................................................................................38第五章甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒前后中肠转录组的构建....................405.1实验材料..........................................................................................................405.2试剂与器材......................................................................................................405.3实验方法..........................................................................................................415.3.1试虫感毒处理........................................................................................415.3.2cDNA的构建和Illumina测序..............................................................415.3.3数据整理及转录本的拼装与分析........................................................425.3.4Unigene基因功能注释..........................................................................435.3.5Unigene表达差异分析..........................................................................435.4结果分析..........................................................................................................445.4.148hD和48hW中肠RNA的质量检测...............................................445.4.2原始数据的输出及过滤........................................................................455.4.3序列的拼接组装....................................................................................465.4.4甜菜夜蛾Unigene功能注释.................................................................465.4.5甜菜夜蛾Unigene的GO分类.............................................................495.4.6甜菜夜蛾Unigene的EggNOG分类....................................................505.4.7甜菜夜蛾Unigene的KEGG分类........................................................505.4.8RNA-Seq整体质量评估.......................................................................515.4.9甜菜夜蛾Unigene表达差异检测.........................................................535.4.10基因的GO富集分析..........................................................................55XV 5.4.11基因的KEGG的富集分析................................................................555.5讨论..................................................................................................................56第六章取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后中肠功能基因的表达量分析........................................................................................................................586.1实验材料..........................................................................................................586.2试剂与器材......................................................................................................586.3实验方法..........................................................................................................586.3.1试虫感毒处理........................................................................................586.3.2中肠免疫基因的筛选............................................................................596.3.3荧光定量引物合成................................................................................596.3.4中肠RNA提取......................................................................................596.3.5反转录为cDNA.....................................................................................606.3.6实时荧光定量PCR反应.......................................................................606.3.7实时荧光定量PCR反应效率的确定...................................................606.3.8基因表达量的比较................................................................................616.4结果..................................................................................................................616.4.1不同寄主植物对甜菜夜蛾感染NPV后肠黏蛋白基因表达量的影响..........................................................................................................................616.4.2不同寄主植物对甜菜夜蛾感染NPV后几丁质酶基因表达量的影响..........................................................................................................................646.5讨论..................................................................................................................67第七章结论与展望....................................................................................................687.1结论..................................................................................................................687.2展望..................................................................................................................68参考文献........................................................................................................................70硕士期间发表的论文....................................................................................................80致谢..............................................................................................................................81XVI 第一章引言1.1研究目的及意义甜菜夜蛾Spodopteraexigua（Hübner）隶属鳞翅目夜蛾科，是一种广食性害虫。核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus,NPV）是一种控制甜菜夜蛾的杆状昆虫病[1]毒，该病毒拥有杀虫效果佳、对环境无影响、不易引起害虫的抗性等优势。前期研究发现，用相同剂量的病毒杀虫剂田间防治甜菜夜蛾时，在不同作物上的病亡[2]率差异较大。然而，揭示这种差异的研究，尚未被广泛报道。植物与昆虫、昆虫[3-5]与病毒的二营养级的交互作用，已有较多文献报道，但植物调节病毒感染昆虫宿主的微观效应及其机制，则记载甚少。因此，涉足这些未知领域的探索，有助于深入了解植物如何利用昆虫病毒防御植食性昆虫。本文拟以“寄主植物（黄豆、甘蓝、蕹菜）、甜菜夜蛾、核型多角体病毒”为研究对象，开展以下几方面的研究内容：1）通过测试不同植物叶片中总酚和5种酶活性含量，分析植物化学物质调控病毒对夜蛾幼虫的致病力；2）利用组织学切片和电镜扫描技术，分析植物对感毒甜菜夜蛾幼虫中肠组织及围食膜结构的影响；3）构建甜菜夜蛾感毒/未感毒中肠转录组及实时荧光定量PCR技术，解析在处理前后基因表达量的差异。简言之，本文将从生理生化及分子生物学角度，解析寄主植物对核型多角体病毒感染宿主的影响及可能机制。预期研究结果，不仅在理论上有助于深入理解三者之间的相互关系，且在害虫防治实践上为在不同作物上利用昆虫病毒防治害虫提供实践意义。1.2文献综述：寄主植物对昆虫病毒感染宿主的影响寄主植物对昆虫病毒感染宿主的影响，已有广泛报道，目前主要集中在生态学效应方面，而从生理生化和分子生物学层面探索该领域的研究，寡受关注。就研究手段而言，这方面的生态学效应研究，主要是以传统的人工肉眼观察为主（这里不详细介绍），而在微观层面，分子生物学有望被广泛应用。1 1.2.1寄主植物对昆虫病毒感染宿主的生态学效应迄今，寄主植物调控昆虫病毒感染宿主的生态学效应研究，主要聚焦于植物[6]调节病毒对夜蛾科害虫的致病力。万年峰研究发现，感毒夜蛾的病亡率、存活时间、半致死剂量（LD50）、半数致死时间（LT50）等致病力指标值，因取食不同[7]寄主植物而不同。例如，Wan和Jiang等研究得出取食玉米和青菜叶的甜菜夜蛾感[8、染病毒后的死亡率高，而取食萝卜叶片后的病亡率低；Monobrullah和Shikano等9]研究结论为取食黄瓜比取食甘蓝的粉纹夜蛾（Trichoplusiani）对TnNPV感受性高[10]（该病毒在甘蓝和黄瓜叶片上的致死中剂量分别为1272和339OBs/larva）；Ali等研究结果为病毒经棉花、绛车轴草和野老鹳草叶片感染谷实夜蛾（Helicoverpazea）后，病毒对该虫的半致死剂量分别为89.36、10.22和38.63OBs/larva；这些研究告诉我们，在运用病毒防治昆虫时，需依据不同作物上的效果差异，设计不同的防控策略。1.2.2寄主植物对昆虫病毒感染宿主的生理生化与分子机制病毒与植物共同作用于昆虫体内后，会引起病毒感染昆虫生理过程的变化，下面重点介绍寄主植物对感毒宿主围食膜结构与组成、围食膜功能的影响。1.2.2.1病毒感染宿主的生理特征变化核型多角体病毒能够与昆虫宿主围食膜上的靶蛋白特异性结合，破坏围食膜，减弱宿主对病毒的抵抗能力。昆虫取食植物后，植物会产生或者被诱导产生的几丁质酶、植物凝集素等物质也会进入昆虫体内破坏围食膜的完整性，进而影响病[11]毒对宿主的致病力。Plymale等研究发现：植物进入昆虫体内，会增加昆虫围食膜厚度，进而降低了病毒感染宿主中肠组织的能力。可以预见，植物既可以单方面改变昆虫围食膜结构，也可以与病毒互作后改变昆虫围食膜结构，进而引发中肠细胞脱落、黑化反应、细胞凋亡等一些生理反应。1.2.2.2影响围食膜结构与组成核型多角体病毒单独进入昆虫体内，会影响昆虫围食膜的物理结构、化学成分、蛋白基因等，当其与植物共同作用于宿主围食膜后，这些特征也会改变。（1）改变物理结构2 [12]围食膜是昆虫防御外界侵害的第一道生理屏障。它位于昆虫中肠和肠腔之间，为非细胞管状薄膜结构，具有多孔性，允许水、盐等小分子通过，将一些较大的入侵物（细菌、病毒颗粒体等）拒之门外。有研究表明，杆状病毒能损坏围[13]食膜的完整性，致使围食膜孔径增大、出现孔洞。此外，有研究发现，杆状病[14]毒与增效蛋白的联合作用对昆虫围食膜结构的破坏更加明显。刘琴等研究发现，甜菜夜蛾幼虫经粘虫颗粒体病毒（PuGv-Ps）和增效蛋白共同处理后，围食膜由原来的表面光滑逐渐表现为粗糙凸起，以致破损降解。有案例表明，昆虫围食膜的厚薄程度与取食的食物种类有关，并且围食膜的厚度决定着昆虫防御病原物入侵的能力。例如，取食叶片的鳞翅目幼虫围食膜比取食饲料的厚，且有较低的病毒[15]感染率和死亡率。科学研究还证实，昆虫围食膜可以将病毒颗粒体紧紧包裹，缩减了病毒与中肠组织的接触空间，进而降低了病毒感染的几率。这在白纹伊蚊[16、17]（Aedesalbopictus）被虫媒病毒感染的研究中，已有报道。然而，当不同植物进入昆虫围食膜内，可能会加快或抑制病毒颗粒体对昆虫围食膜的破坏。（2）引起类型分化[18]围食膜可分为Ⅰ型和Ⅱ型。鳞翅目和一些直翅目幼虫的围食膜大多数属于Ⅰ型，该类型的结构为多层重叠管状，由中肠上皮细胞分泌而成，Ⅱ型围食膜多在双翅目、革翅目等翅目幼虫中出现。观察发现，Ⅱ型围食膜比Ⅰ型的更有规则、[19]有序。昆虫取食不同食物后，其围食膜形成及类型往往也会发生变化。尤其，[20]有毒有害的液体食物对昆虫围食膜影响较为明显。研究发现，取食血液等无菌或者少菌液体食物的昆虫，一般不会形成围食膜，而摄取污染程度高的食物（如粪便、腐烂水果）的昆虫，则会保留围食膜。此外，有些围食膜的类型与其发育阶段有关，如蚊幼虫期的围食膜为Ⅱ型，而雌性成虫却为Ⅰ型。然而，有的昆虫[21]围食膜类型与其发育阶段无关。例如，幼虫期红头丽蝇。综上，食物（植物、饲料、外来有害液体）、发育历期等因素会影响围食膜类型的变化，可以预见，病毒和植物共同进入昆虫体内，也会影响围食膜类型分化。（3）影响化学成分围食膜主要由蛋白质、几丁质和多糖构成。昆虫围食膜上的蛋白质主要是糖蛋白，能增强围食膜的半渗透性和致密性，其含量在所有组分中最高（占20~55%）。按照提取易难程度，将蛋白归为4类：1）在高或低浓度的盐溶液中，易被移除的[22]蛋白；2）能够被温和去垢剂去除的蛋白；3）需强变性剂才能洗脱的蛋白；4）3 [23]在围食膜上以共价键结合的蛋白。前3种蛋白均不能被移除。其次，几丁质含量高（4~20%）。几丁质在几丁质合成酶的作用下，由GlcNAc借助β-(1,4)糖苷键形成[24]。此外，围食膜中还含有较少量的多糖，该类物质往往决定围食膜的致密性，其含量因昆虫种类不同而有所差异。譬如，甜菜夜蛾与华北大黑鳃金龟（Holotrichia[25][26]oblita）围食膜中糖含量分别占2.05%和8.91%。电镜观察视野下发现：十根（或大于十根）同向排列的几丁质微纤丝耦合成微管微纤丝束，多个微管微纤丝[27-29]束又进一步耦合形成围食膜。研究发现，杆状病毒感染昆虫后，对其围食膜结构蛋白影响最大。如感染杆[30]状病毒后，粘虫（Mythimnaseparata）围食膜蛋白丢失，进而引起围食膜渗透性[31]发生变化。此外，病毒增效蛋白能加剧病毒对围食膜蛋白的破坏。例如，棉铃虫颗粒体病毒（HaGV）的增效蛋白能将棉铃虫围食膜蛋白HaIIM86降解为70、90KD。[32]然而，据Shi等报道，倍带夜蛾杆状病毒（MacoMNPV）增效蛋白对蓓带夜蛾（Mamestraconfigurata）围食膜蛋白McMUC4无影响。诚然，杆状病毒对昆虫围食膜蛋白的影响已受关注，但病毒如何调控围食膜上的几丁质和多糖，还有待进一步探讨。再者，植物如何调控病毒增强或抑制围食膜蛋白质、几丁质、多糖等化学物质含量的效应及其机制，值得深思。（4）调控蛋白基因迄今，杆状病毒对昆虫围食膜蛋白基因的影响，主要集中研究几丁质蛋白基因。[33]如Levy研究发现，梨豆夜蛾（Anticarsiagemmatalis）感染核型多角体病毒（AgMNPV）后，抗AgMNPV品系的几丁质蛋白基因含量较敏感品系的高；[34]Jakubowska等报道，棉铃虫（Helicoverpaarmigera）感染棉铃虫多角体病毒（HearNPV）后，中肠几丁质去乙酰基酶表达量下降。科学证实，蛋白基因维系着昆虫围食膜结构的稳定性，若这种稳定性被破坏，围食膜的结构与功能也将会[35]受到严重影响。陈艳萍研究家蚕（Bombyxmori）被核型多角体病毒（BmNPV）感染后，其丝氨酸蛋白酶基因的表达量在感染后早期显著上调，究其原因，该基因与丝氨酸蛋白酶2（简称“BmSP-2”，一种具有强大抗BmNPV活性的蛋白基因）具有高度相似性。然而，多糖也是围食膜不可缺少的成分，合成多糖的酶系基因如何响应杆状病毒的感染，有待进一步研究挖掘。此外，取食不同植物的感毒宿主的围食膜蛋白基因如何表达，值得探索。4 1.2.2.3调节围食膜的功能科学发现，围食膜对中肠细胞有机械保护、化学保护、选择透性、区室化作用等功能。植物与病毒共同作用于昆虫围食膜后，可能会引起这些功能的改变。（1）机械保护虽然围食膜是外界病原菌侵入的重要位点，但同时它也具有防止这些微生物[36]入侵的功能。围食膜上存在润滑作用的类凝胶物质，它使食物能够顺利通过中肠，避免昆虫因食用大颗粒物质而引起中肠涨裂。围食膜的糖位点通过吸附病原[37]微生物，保护中肠上皮细胞。昆虫围食膜对杆状病毒具有一定的抵御能力，这种功能在一定程度上保护了中肠上皮细胞免受病毒破坏。此外，化学物质能够影响围食膜的保护作用。譬如，刚果红能干扰昆虫围食膜的功能，这是因为刚果红与蛋白质竞争性结合几丁质，致使围食膜功能发生紊乱，但这种紊乱具有暂时性。植物进入昆虫体内，可能会增强或减弱围食膜对病毒的抵御能力。（2）化学保护围食膜不仅能阻止中肠细胞对金属离子的吸收，而且能将其排出体外。Abedi[38]等研究埃及伊蚊（Aedesaegypti）被DDT处理后，发现有大量的围食膜被排除体外，这可能是围食膜与有毒物质结合、产生螯合作用的结果。研究证实，昆虫围食膜的黏蛋白可以消除重金属离子的危害，但某些幼虫对重金属离子反应敏感。[39]如铜和镉强烈影响冈比亚按蚊（Anophelesgambiae）围食膜。此外，昆虫围食膜对植物释放的有毒有害物质也具有抵御作用。围食膜对某些植物体内释放的金属离子，也具有吸附功能，这种吸附效应可能会增强昆虫中肠对杆状病毒的免疫能力。（3）选择透性昆虫围食膜是一种具有选择透性的薄膜，其选择透性与其孔膜结构、食物通过围食膜速度等有关。研究表明，鳞翅目和直翅目昆虫围食膜的孔径分别为21~29、[40]24~36nm，食物的流量分别为32~159、98~2821ng/h。围食膜能够从中肠上皮细胞中分离大部分的单宁酸和其他异种化感物质，但却允许其他小分子的酚类物质、营养物和消化酶进入。有案例发现，围食膜结构受几丁质酶的影响，几丁质酶作[41]用时间越长，围食膜损害就越大，选择透过性也越低。围食膜的通透性与蛋白[31]多糖的抗击压性能和几丁质纤维丝弹性有关，也与中肠的位置有关。据报道，[28]低温使围食膜产生孔洞和缝隙，进而使其通透性发生变化。某些昆虫的围食膜5 [42]组分会存在性二型现象，譬如，雄性刺舌蝇。此外，外源凝集素分子能干扰围食膜通透性，它与围食膜蛋白、几丁质或上皮细胞的糖基化位点结合，从而使围食膜通透性降低。杆状病毒进入昆虫体内，破坏了昆虫围食膜结构，势必降低其选择透性。植物几丁质酶通过昆虫取食进入体内，造成围食膜结构的损伤。可以想象，某些几丁质酶含量较高的植物，会加速杆状病毒对昆虫围食膜选择透性的破坏。（4）区室化作用位于昆虫中肠内部的围食膜，将肠腔分为内外两个空间。围食膜相当于一个分子筛，可使一些消化酶（如分子量较小的淀粉酶）和已被消化完全的营养物质透过，而将一些物质（如分子量较大的氨肽酶和羧肽酶）阻挡在外间隙内。经围食膜消化产生的小分子物质（如寡糖和多肽等），可与消化酶再次发生作用而进行二次消化。据报道，肠腔的区室化加快了营养物质在其内外的流动，易被消化分离，从而提高中肠吸收营养的效率。有文献表明，当食物（包括植物营养物质）[20]流向围食膜过程中，食物流的方向与围食膜外侧液的流向相反，该流动方式可以提高消化酶利用率和食物消化率，有利于保存营养物质。在昆虫摄取食物的过程中，营养物质会流向围食膜后方，产生外侧液，形成压力差，提高食物的消化率。然而，病毒颗粒体作用于围食膜后，其区室化作用，可能会被减弱，主要是因病毒可以破坏围食膜。（5）其他功能据文献记载，围食膜还具其他功能：一是抗氧化作用，如保护昆虫中肠上皮[43][44]细胞免受氧化剂的损伤；二是促使茧的形成。昆虫被杆状病毒感染后，昆虫通过抗氧化作用，抵御病毒入侵。植物如何调控病毒影响宿主昆虫的抗氧化作用，有待进一步探究。此外，病毒感染宿主后，肯定会削弱昆虫结茧的能力，但植物如何调控这种能力，该方面的疑团待深入探索。1.2.3研究手段：转录组学研究进展利用转录组学，研究植物、植食性昆虫和昆虫病毒之间的关系，正被学术界广泛认可。利用该技术探索寄主植物对昆虫病毒感染宿主的影响，具有重要学术意义，但该方面研究罕见报道，下面扼要介绍该领域的信息。6 1.2.3.1转录组及转录组学概述广义上的转录组（Transcriptome），是指生物体内所有转录产物的总和，狭义上是指具有翻译功能mRNA总和。转录组主要是研究生物体基因的表达，它是连接基因组和蛋白质组的中间桥梁。转录组学（Transcriptomics）是研究基因转录、调控转录规律的学科。利用转录组学有利于研究分析细胞内基因的表达情况和调控模式，同时也是发现新基因、注释基因功能的重要方法。1.2.3.2转录组测序技术的发展及RNASeq原理[45、46]在1977年，发明了第一代测序技术双脱氧链终止法测序，其测序弊端是费用昂贵，速度慢，通量低。第二代测序技术测序成本降低，测序速度加快，准[47]确度提高。第二代测序技术主要是Roche454（焦磷酸测序法），Iillumina（Solexa）[48][49]（聚合酶合成测序法）和ABI（Solid）（连接酶测序法）。2008年第三代测序技术出现。目前，该测序技术已应用于昆虫基因组研究中。RNASeq（RNAsequencing）又称为转录组测序，是一种借助高通量测序技术，来确定不同来源的[50]RNA片段在目的样本中含量的技术。RNASeq的技术原理：首先获得样本中的RNA，使mRNA纯化，并且片段化，然后再逆转录生成cDNA，得到文库，在cDNA[51]两端加上接头，最后进行测序。查阅文献发现，李春雨利用该技术，分析了甜菜夜蛾蛹黑突变型和正常型的特征。然而，运用该技术分析感毒和非感毒甜菜夜蛾的特征，以及解析寄主植物影响感毒甜菜夜蛾的这些特征，有待探索。7 1.3本研究技术路线图寄主植物对甜菜夜蛾核型多角体病毒感染宿主的影响植物化学物质调寄主植物对幼寄主植物对幼控病毒对幼虫的虫中肠及围食虫中肠功能基致病力膜的影响因的影响总死数半中围中中酚亡致致肠食肠肠酶含间率死死石膜转达功测量的与时剂蜡电录量能定及测存间量切镜组分基主定活测与片扫分析因要时定半描析表解析寄主植物对甜菜夜蛾核型多角体病毒感染宿主的影响图1-1技术路线图Fig.1-1Technicalroadmap8 第二章植物化学物质调控核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫的致病力植物、昆虫和病毒三者之间的互作关系，是当前研究生态学和昆虫学的重要[53]组成部分。长期以来，科学发现植物可以利用害虫的天敌（如捕食者和寄生蜂）作为防御因子来保护自身免受害虫的危害。然而，植物是否可利用昆虫病毒作为防御因子，寡受关注。核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus,NPV）作为昆虫病[54]毒，已被广泛应用于鳞翅目害虫防治中。目前，已有研究证实，寄主植物能影[55、56]响该病毒对夜蛾科害虫的致病力。甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）是一种广食[57、性害虫危害全球的蔬菜和农作物，核型多角体病毒是该昆虫的重要生物防治剂58]。我们前期研究发现，在使用相同剂量的病毒控制甜菜夜蛾时，该病毒在黄豆（Glycinemax）、甘蓝（Brassicaoleracea）和蕹菜（Ipomoeaaquatica）上的防治效果存在显著差异。因此，本文选择了这3种植物叶片，并以人工饲料为对照，观察了植物化学物质调控病毒对甜菜夜蛾幼虫的致病力，并测试了这些植物叶片中的化学物质，以期为认识植物利用病毒充当“保镖”抵御害虫的生理机制提供资料。2.1实验材料供试虫源为本研究组室内连续饲养多代的甜菜夜蛾幼虫。幼虫置于人工气候培养箱喂养至化蛹，蛹羽化为成虫后，将雌雄成虫配对，置于产卵瓶中产卵，并在瓶底放置浸有10%蜂蜜水的棉花球作为成虫的补充营养。取卵块放置在4个培养盒中，幼虫孵化后分别喂食人工饲料（主要成份为麦胚、黄豆粉、抗坏血酸等）、黄豆、甘蓝和蕹菜，选择个体大小一致的2龄末至3龄初幼虫作为实验材料。甜菜夜蛾饲养条件：相对湿度80±5%、温度为（27±0.5）℃、光周期L:D=14:10。供试病毒为本研究组保存的甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeMNPV）上海株。将感染核型多角体病毒的甜菜夜蛾幼虫虫尸进行研磨，然后加入PBS缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0），经多层纱布过滤后，低速离心（400r/min，10min），弃沉淀，上清液经PBS稀释后进行高速离心（3000r/min，30min），去除上清杂质。重复上述过程，直至悬浮液为乳白色，此时即为病毒原液，置于4℃冰箱中备用。将纯化9 好的病毒液稀释1000倍，400倍相差显微镜下，用托马斯血细胞板计数，然后稀释为所需浓度的病毒液。供试植物为黄豆（辽鲜一号）、甘蓝（兴绿一号）和蕹菜（柳叶空心菜），均种植在含有草炭与椰土混合物的塑料盆内，长至3-5片真叶时供试验用。2.2试剂与器材主要试剂及其配制：福林试剂，碳酸钠，蜗牛酶，愈创木酚，蛋氨酸（MET），氮蓝四唑（NBT），乙二胺四乙酸（EDTA），核黄素，几丁质，对二甲氨基苯甲醛（DMAB），四硼酸钠等均购自国药。（1）0.2mol/LPBS：称取2.3gNaH2PO4·2H20，29gNa2HPO4·12H20加入蒸馏水，调节pH至7.4，定容至500mL，121℃灭菌20min，然后冷却至室温。（2）0.05mol/L愈创木酚：称取6.2065g的试剂溶于500mL95%乙醇中，稀释2倍，4℃保存。（3）0.013mol/LMET：称取0.194gMET加入到100mLPBS中，搅拌均匀，4℃保存。（4）1%胶体几丁质溶液：将5g几丁质加入到200mL的浓盐酸中，37℃水浴，直至溶液澄清，将溶液过滤到2L蒸馏水中，搅拌。半小时后，4℃沉淀过夜。离心收集沉淀，蒸馏水冲洗，并将其调为中性。取5mL溶液，烘烤至恒重，测含量，配制为1%。（5）1%DMAB：取1gDMAB，加入适量冰醋酸使其溶解，再加入浓盐酸1.25mL，用冰醋酸定容到100mL。（6）饱和硼酸溶液：称取5.0gNa2B4O7·10H2O，溶于100mL的热水中。实验器材：立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅），FA1004电子分析天平（上海楚伯），PHS-25雷磁PH计（杭州科博），85-2恒温磁力搅拌器（上海司乐），DK-S22电热恒温水浴锅（上海精宏），RXZ人工气候培养箱（宁波仪器厂），752紫外可见光分光光度计（上海元析）。2.3实验方法2.3.1试虫感毒处理[52]3参照Raymon等的叶碟法，对甜菜夜蛾进行感毒处理。将人工饲料（0.025cm）和打成叶碟的3种植物叶片（直径0.5cm）分别置于组织培养板（48孔）内。用10 微量进样器分别滴1µL病毒液和无菌蒸馏水（空白对照）于人工饲料和叶片上，66544-15种病毒液浓度为9.375×10、1.875×10、3.75×10、7.50×10、1.50×10OBs·mL，即叶碟上的病毒剂量为9375、1875、375、75或15OBs。将已饥饿12h的甜菜夜蛾3龄初幼虫放在室温晾干的人工饲料和叶碟上（每孔1头幼虫），取食。用橡皮筋固定组织培养板，防止甜菜夜蛾幼虫逃脱。24h后取食完食物的幼虫分别补充未添加病毒的人工饲料和相应植物继续饲养（此时计为感毒后0h），而未取食完食物的幼虫将被剔除以确保感毒组每头幼虫都摄入等量的病毒剂量。最后，将感毒组和对照组分别放在不同的人工气候培养箱中喂养，以防止对照组幼虫受病毒影响。对照组和处理组重复3次，每重复48头幼虫，观察统计昆虫的死亡数。2.3.2总酚含量[59]参照Folin-Ciocateu法测定3种植物叶片提取液的吸光度值，再通过建立的标准曲线(以儿茶酚作标准曲线)折算出叶片总酚含量。每种植物被重复测试3次，即每种植物叶片样品的吸光度分别被测试3次。称取0.5g新鲜采摘的叶片，加入3mL乙醇（95%），充分研磨后，5mL乙醇（95%）过滤，并且定容至25mL。在离心管中分别加入待测液，福林试剂，10%碳酸钠溶液各2mL，摇匀，静置1h。蒸馏水为对照，测OD700值。2.3.3过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性2.3.3.1过氧化物酶（POD）活性酶的粗提取液：称取0.5g新鲜采摘的叶片，加入5mLPBS（0.1mol/L，pH＝7.4），研磨，定容至25mL。8000r/min离心10min，上清液即为所需酶的粗提取液，4℃冰箱保存。反应混合液的制备：将愈创木酚28µL加入到50mLPBS中，加热搅拌，充分溶解，室温冷却后，加入19µL30%H2O2，混合均匀，4℃冰箱保存。酶活测定：待测管为3mL反应混合液和0.1mL粗酶液。以缓冲液代替酶液作对照。测OD470nm值，每30s记录1次，记录4min。2.3.3.2过氧化氢酶（CAT）活性11 酶的粗提取液制备方法如2.3.3.1S0为对照管，S1、S2为样品管。S0依次加入0.2mL煮死的粗酶液，1.5mLpH7.8磷酸缓冲液和1.0mL蒸馏水。在S1、S2中分别加入0.2mL粗酶液、1.5mLpH7.8磷酸缓冲液和1.0mL蒸馏水。如下表：表2-13支试管中的化学物质比例Table2-1Theproportionofchemicalsubstancesin3testtubesS0S1S2粗酶液(mL)0.2(煮死)Inactivation0.20.2CrudeenzymesolutionpH7.8磷酸缓冲液(mL)1.51.51.5PH7.8PBS蒸馏水(mL)1.01.01.0distilledwater25℃预热，S0、S1和S2均加入0.3mLH2O2（0.1mol/L），快速测OD240值，隔1min测1次，测4min。2.3.3.3超氧化物歧化酶（SOD）活性酶的粗提取液制备方法如2.3.3.1反应混合物制备：在小烧杯中加入1.7mLPBS（0.050mol/L）、0.3mLMET（0.013mol/L）、0.3mLNBT（0.750µmol/L）、0.3mLEDTA（0.1mmol/L）和0.3mL核黄素（2µmol/L），再加入0.1mL酶粗提取液，加蒸馏水至3mL，均匀混合。将无酶液烧杯置于暗处调零，另一个无酶液烧杯和有酶液烧杯用荧光灯管（40w，3个），光照15min,立即终止暗处理，用分光光度计测OD560，用无酶液（照光）作空白。2.3.4几丁质酶活性称取0.5g新鲜采摘的叶片，研磨，加入2mL醋酸缓冲液（0.05mol/L，pH＝5.0）混匀，吸取到2mL离心管，12000r/min离心15min，留上清液，然后分别测外切和内切几丁质酶活性。12 2.3.4.1外切几丁质酶活性反应混合物制备：分别吸取粗酶提取液、醋酸缓冲液和1%胶体几丁质溶液各0.4mL，混匀，37℃水浴2h，4000r/min离心10min，终止反应。[60]按照Reissig等方法，测N-乙酰葡萄糖胺量（GlcNAc）：吸取饱和硼砂溶液0.2mL加入0.4mL上清液中，沸水浴8min，冷却至室温，再加入2mL冰醋酸和1mL1%DMAB，37℃水浴20min，测OD585。2.3.4.2内切几丁质酶活性将0.4mL上清液与40μL1%蜗牛酶溶液混匀后，37℃水浴反应30min，依[60]据Reissig等（1955）测GlcNAc的方法，算出总几丁质酶活性。内切几丁质酶活性＝总几丁质酶活性—外切几丁质酶活性。表2-2N-乙酰葡萄糖胺量标准曲线的制备Table2-2PreparationofN-acetylglucosaminestandardcurve配置100μg/mLGlcNAc母液管号123456789100µg/mL00.050.100.150.200.250.300.350.40GlcNAc(mL)H2O(mL)0.40.350.300.250.200.150.100.050GlcNAc浓度(µg/mL)012.52537.55062.57587.5100GlcNAcconcentration向试管中加入饱和硼酸溶液0.2mL，沸水浴8min，冷却至室温，再加冰醋酸2mL，1%DMAB1mL，37℃水浴20min，测OD585。Addingsaturatedboricacidsolution0.2mL,boilingwater8min.Aftercooling,eachtubeisaddedtotheaceticacid2mL,1%DMAB1mL,then20mininwaterat37℃,andmeasurementofOD585.2.4数据处理数据分析前，在SPSS16.0软件平台上使用Kolmogorow-Smirnov检验进行正态分布分析，并用Levene’s测试进行同质性分析。用两因素（食物资源、病毒剂量）[61]一般线性模型（GeneralLinearModel,GLM）分析幼虫的校正病亡率和幸存时间13 [62]，食物资源为黄豆、甘蓝、蕹菜，病毒剂量为9375、1875、375、75、15OBs/幼虫。使用单因素方差分析进一步比较取食不同食物后感毒幼虫的4个易感性指标校正死亡率、幸存时间、半致死剂量（LD50）和半数致死时间（LT50）的差异，以及分别比较3种植物叶片化学物质（总酚、过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、内切几丁质酶和外切几丁质酶）含量的差别（Tukey’sHSD检验，P＜0.05）。根据拟合病死率与病毒剂量、病死率与幼虫幸存时间之间的线性回归方程，计算[63]病毒对幼虫的LD50和LT50。拟合校正死亡率与幸存时间之间的指数方程，以明确幼虫病亡与幸存时间的关系。拟合半致死剂量/半数致死时间与叶片化学物质含量之间的指数方程，以揭示植物叶片化学物质调控幼虫病亡的生理机制。校正死亡率（%）=（病毒处理组死亡率—健康组死亡率）/（1—健康组死亡率）。幼虫幸存时间=（第1头幼虫幸存时间+第2头幼虫幸存时间+···+第n头幼虫幸存时间）/n。Tukey’sHSD检验多重比较取食不同食物后病毒对幼虫的LD50和LT50的差异。多重比较时，将LD50数据平方根转换，对校正病亡率数据进行反正弦平方根转换。2.5结果与分析2.5.1校正死亡率和幸存时间表2-3影响核型多角体病毒对甜菜夜蛾致病力的食物资源和病毒剂量的两因素方差分析Table2-3Two-wayanalysisofvariancefortestingtheeffectsoffoodresourcesandvirusdosesontheinfectivityofNPVtobeetarmywormlarvae变量食物资源病毒剂量互作效应DependentFoodresourcesVirusdoseInteractiveeffectvariableF值自由显著水平F值自由显著水平F值自由度显著水平Fvalue度SignificantFvalue度SignificantFvaluedfSignificantdfleveldflevellevel780.9063,40<0.0011.860×103校正死亡率4,40<0.00116.18812,40<0.001Correctedmortality159.4793,40<0.0011.411×103存活时间4,40<0.0016.39712,40<0.001Meantimetodeath两因素方差分析表明，食物资源、病毒剂量以及两者的交互效应对甜菜夜蛾幼虫校正死亡率和幸存时间都有显著影响（表2-3）。14 aa1009375OBsperlarva1001875OBsperlarva9090aa80bb807070bb60605050404030302020)101000人工饲料黄豆甘蓝蕹菜人工饲料黄豆甘蓝蕹菜10010090375OBsperlarva9075OBsperlarva校正死亡率80aa807070Correctedmortality(%6060aab50b50b4040c30302020101000人工饲料黄豆甘蓝蕹菜人工饲料黄豆甘蓝蕹菜10015OBsperlarva9080706050aa40bc3020100人工饲料黄豆甘蓝蕹菜食物资源Foodresources图2-1取食不同食物后感毒甜菜夜蛾幼虫的校正死亡率(误差棒表示标准误)Fig.2-1CorrectedmortalityofbeetarmywormlarvaefedaliquotsofNPVondifferentfoodsources15 10.010.09.09375OBsperlarva9.01875OBsperlarva8.08.0a7.07.0b6.0aa6.0cc5.0bb5.04.04.03.03.02.02.01.01.00.00.0人工饲料黄豆甘蓝蕹菜人工饲料黄豆甘蓝蕹菜M10.0375OBsperlarva10.075OBsperlarvaaab9.09.0cbc幸存时间8.0aa8.07.0bb7.06.06.0eansurvaltimetodeath(d)5.05.04.04.03.03.02.02.01.01.00.00.0人工饲料黄豆甘蓝蕹菜人工饲料黄豆甘蓝蕹菜15OBsperlarva10.0aabbab9.08.07.06.05.04.03.02.01.00.0人工饲料黄豆甘蓝蕹菜食物资源Foodresources图2-2取食不同食物资源后感毒甜菜夜蛾幼虫幸存时间(误差棒表示标准误)Fig.2-2MeansurvaltimetodeathofbeetarmywormlarvaefedaliquotsofNPVondifferentfoodsources16 100Y=238.336e─0.210X90(R²=0.874,P<0.001)807060504030校正死亡率20Correctedmortality1004.05.06.07.08.09.010.0幸存时间Meansurvaltimetodeath(d)图2-3取食不同食物资源后感毒甜菜夜蛾幼虫幸存时间与校正死亡率的指数关系Fig.2-3ExponentialrelationshipbetweenthemeansurvaltimetodeathandcorrectedmortalityforthesusceptibilityofbeetarmywormlarvaetoNPVfeedingondifferentfoodsources在5种病毒剂量的处理下，幼虫的校正死亡率和幸存时间均受食物资源的影响（校正死亡率：9375OBsperlarva，F3,6=94.807，P<0.001；1875OBsperlarva，F3,6=140.701，P<0.001；375OBsperlarva，F3,6=358.611，P<0.001；75OBsperlarva，F3,6=151.738，P<0.001；15OBsperlarva，F3,6=94.807，P<0.001。幸存时间：9375OBsperlarva，F3,6=5.897，P=0.032；1875OBsperlarva，F3,6=78.474，P<0.001；375OBsperlarva，F3,6=136.812，P<0.001；75OBsperlarva，F3,6=15.029，P=0.003；15OBsperlarva，F3,6=5.897，P=0.032）（图2-1和图2-2，柱形上不同小写字母表示在5%水平上差异显著）。取食病毒处理的人工饲料或黄豆的幼虫，具有较高的校正死亡率，较短的幸存时间，而取食病毒处理的甘蓝或蕹菜后，其校正死亡率较低、幸存时间较长。指数拟合结果表明，感毒甜菜夜蛾的死亡率随幸存时间的延长而降低（图2-3）。17 2.5.2半致死剂量和半数致死时间1400a12001000LD50800b600400半致死剂量(OBsperlarva)200cc0人工饲料黄豆甘蓝蕹菜9.0aa8.0bc7.0LT506.05.0(d)4.03.02.0半数致死时间1.00.0人工饲料黄豆甘蓝蕹菜图2-4不同食物病毒对甜菜夜蛾幼虫的半致死剂量和半数致死时间(半致死剂量数据平方根转换后进行方差分析；误差棒表示标准误)Fig.2-4Medianlethaldose(LD50)andmedianlethaltime(LT50)ofNPVtobeetarmywormlarvaeconsumingaliquotsondifferentfoodsources食物资源显著影响病毒对甜菜夜蛾幼虫的半致死剂量和半数致死时间（one-wayANOVA，半致死剂量：F3,6=408.188，P<0.001；半数致死时间：F3,6=68.661，P<0.001），蕹菜上的半致死剂量显著大于其他3种食物，为1222.4OBs（perlarva），黄豆和人工饲料上的半致死剂量最小，分别为110.5、107.6OBsperlarva。半数致死时间大小次序依次为：黄豆（8.09d）>人工饲料（7.92d）>甘蓝（7.39d）>蕹菜（6.83d）（图2-4）。18 2.5.3叶片化学物质含量比较4035aCAT)30a-1)25-1min•20-1Totalphenols(g15(mg•L过氧化氢酶10b总酚50蕹菜甘蓝黄豆60aaSOD50))-1POD-140minmin-1•30b•-1(g(g20过氧化物酶超氧化物歧化酶100蕹菜甘蓝黄豆))-1-170mL80amL••a6070bbcb(μg(μg6050504040内切几丁质酶外切几丁质酶-chitinase30302020ExoEndochitinase101000蕹菜甘蓝黄豆蕹菜甘蓝黄豆图2-5不同植物叶片化学物质含量比较(误差棒表示标准误)Fig.2-5Comparisonofchemicalcontentamongdifferentplantfoliage不同植物叶片中的6种化学物质含量存在显著差异（one-wayANOVA，总酚：F2,4=40.854，P<0.001；过氧化氢酶：F2,4=34.616，P=0.003）；过氧化物酶：F2,4=149.071P<0.001；超氧化物歧化酶：F2,4=178.284，P<0.001；内切几丁质酶：F2,4=114.232，P<0.001；外切几丁质酶：F2,4=105.66，P<0.001）。总酚和过氧化物酶大小次序均为：蕹菜>甘蓝>黄豆，过氧化氢酶、内切几丁质酶和外切几丁质酶大小次序均为：黄豆>甘蓝>蕹菜，超氧化物歧化酶大小次序为：甘蓝>黄豆>蕹19 菜（图2-5）。2.5.4半致死剂量/半数致死时间与叶片化学物质含量关系2000Y=1934.300e0.069X2000Y=111.586e0.030X1800(R²=0.546,P=0.023)1800(R²=0.743,P=0.003)1600160014001400120012001000100080080060060040040020020000102030405060708090100110010203040-1-1-1总酚Totalphenols(mg•L)过氧化氢酶CAT(g•min)-12000Y=33.869e0.0229X(mg•L)2000Y=3075.600e0.043X1800(R²=0.849,P<0.001)1800(R²=0.286,P=0.138)va)160016001400140012001200Medianlethal10001000800800(OBsperlar600600dose400400200200半致死剂量004050607080901001101201301401501601701802030405060-1-1-1-1超氧化物歧化酶SOD(g•min)过氧化物酶POD(g•min)2000Y=8.017×107e0.187X2000Y=6.484×108e0.262X1800(R²=0.882,P<0.001)1800(R²=0.977,P<0.001)16001600140014001200120010001000800800600600400400200200004850525456586062586062646668707274内切几丁质酶Endochitinase(μg•mL-1)外切几丁质酶Exo-chitinase(μg•mL-1)图2-6半致死剂量与叶片化学物质含量之间的指数关系模拟Fig.2-6Exponentialrelationshipbetweenmedianlethaldose(LD50)ofNPVtobeetarmywormlarvaeandchemicalcontent20 9.0Y=8.235e0.002X9.0Y=6.624e0.0054X(R²=0.884,P<0.001)8.5(R²=0.718,P=0.004)8.58.08.07.57.57.07.06.56.56.06.0102030405060708090100110010203040-1-1总酚Totalphenols(mg•L-1)过氧化氢酶CAT(g•min)-19.0Y=8.956e0.002X(mg•L)9.0(R²=0.960,P<0.001)Y=6.239e0.0039X8.58.5(R²=0.504,P=0.032)(d)8.08.07.57.57.07.06.56.5半数致死时间6.06.0Medianlethaltime4050607080901001101201301401501601701802030405060-1-1-1-1过氧化物酶POD(g•min)超氧化物歧化酶SOD(g•min)9.0Y=3.580e0.0113X9.00.0177XY=2.845e(R²=0.690,P=0.011)8.58.5(R²=0.961,P<0.001)8.08.07.57.57.07.06.56.56.06.05860626466687072744850525456586062-1-1内切几丁质酶Endochitinase(μg•mL)外切几丁质酶Exo-chitinase(μg•mL)图2-7半数致死时间与叶片化学物质含量之间的指数关系模拟Fig.2-7Exponentialrelationshipbetweenmedianlethaltime(LT50)ofNPVtobeetarmywormlarvaeandchemicalcontent21 半致死剂量与叶片化学物质含量之间的指数关系模拟结果表明，病毒对甜菜夜蛾幼虫的半致死剂量随叶片中总酚和过氧化物酶含量的升高而升高，而随其他4种化学物质含量的升高而降低（图2-6）。半数致死时间与叶片化学物质含量之间的指数关系模拟结果显示，叶片中总酚和过氧化物酶含量越高，病毒对甜菜夜蛾幼虫的半数致死时间越短，而其他4种化学物质含量的增加均能引起半数致死时间的延长（图2-7）。2.6讨论迄今，不同植物上昆虫病毒对宿主昆虫的致病性已有较多报道，尤其以谷实[64][65、66]夜蛾和烟芽夜蛾（Heliothisvirescens）为模式昆虫的研究最多。有案例表[64][67][68]明，感毒夜蛾取食黄豆后，其死亡率较高、幸存时间较短、LD50较低、LT50[7][69、70]较短，而取食甘蓝后，这4个易感性指标呈相反趋势，这些研究结果都与本研究结论相一致。此外，本研究表明，取食蕹菜的昆虫相对于取食黄豆和甘蓝病毒致病力更低。这种致病性差异可以指导种植者：当使用病毒控制甜菜夜蛾时，要基于其对不同作物的影响差异，科学地制定控制策略，以避免浪费病毒杀虫剂。本研究表明，核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫的较强致病力与黄豆叶片中较低的酚类含量有关；病毒经甘蓝和蕹菜叶片感染幼虫后，其半致死剂量是经黄豆叶片感染幼虫的6.4、11.1倍，这与甘蓝和蕹菜叶片较高的酚类物质有关（这两种植物酚类物质分别是黄豆的2.6、5.5倍）。植物叶片中的酚类物质降低昆虫病毒对宿主的致病性已成科学定论，而酚类物质降低这种致病性主要依靠植物中的过氧[71][66]化物酶POD。植物叶片中的POD能催化酚类物质氧化，使酚类物质能与病毒颗粒体形成聚集体，集聚成酚类蛋白壳，导致病毒不能释放出包涵体[72]（Occlusion-derivedvirusparticles），进而使病毒感染夜蛾的效能下降。有研究发现，随着植物中POD活性的增高，感毒虫体死亡率降低，这在取食紫叶生菜和[73]棉花叶片的烟芽夜蛾对病毒的致病性与POD的关系中得到了证实。POD抑制昆虫病毒对宿主昆虫的致病性如上所述已有详实报道，本研究也证实了这个观点。然而，两种氧化应激酶——过氧化氢酶CAT和超氧化物歧化酶SOD，却增强了昆虫对病毒的易感性，其可能原因是昆虫病毒感染甜菜夜蛾后，促使昆虫宿主细胞产生氧化应激反应，释放大量活性氧自由基，为了抵消氧化应激反应，昆虫中肠细胞脱落，死亡率增加。此外，CAT抑制POD活性，因为POD使用H2O2作为辅酶，[74]因此用CAT分解H2O2会降低POD活性。此外在活性氧自由基的作用下病毒复制22 [75]增强，这种现象在流感病毒感染畜禽的研究中得到了证实；当植物氧化应激酶进入甜菜夜蛾幼虫肠道时，病毒复制能力再次增强。此外，本研究发现，内切几丁质酶和外切几丁质酶也能增强病毒对甜菜夜蛾幼虫的致病力。出现这种现象的原因可能是，这两种酶进入甜菜夜蛾体内时，造成中肠围食膜的几丁质降解，破[76]坏了围食膜结构的完整性，而围食膜受损后有助于病毒的入侵，导致宿主死亡率增大。事实上，植物化学物质会影响昆虫免疫功能，这会影响病毒感染前，病毒摄入和病毒感染后。此外，植物还可以影响昆虫生理学，如围食膜的厚度和昆虫的[77]发育年龄（即发育抗性）。但是植物化学物质对这些方面的影响还有待进一步探讨。23 第三章取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后中肠组织的变化3.1实验材料甜菜夜蛾，SeMNPV及植物来源见第二章2.1。3.2试剂与器材主要试剂及其配制：无水乙醇，冰醋酸，氯仿，石蜡（50~52℃，52~54℃）等均购自国药，中性树胶封片剂，Hematoxylin-Eosin(HE)StainingKit等购自上海生工。1%盐酸酒精：在99mL70%酒精中加入1mL浓盐酸，4℃保存。卡诺氏固定液（Carnoy）：无水乙醇：氯仿：冰醋酸=6:3:1的比例进行配制，现配现用。实验器材：SD1508A轮转式切片机（浙江科迪），DM4000B莱卡生物显微镜（德国莱卡），SMZ745TNikon体视显微镜（上海仁科），GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅）。3.3试验方法3.3.1试虫感毒处理6-1用微量进样器滴1µL浓度为1.120×10OBs·mL的病毒液于叶片和人工饲料上，其他处理方法同第二章2.3.1。对照组和处理组重复3次，每重复54头幼虫。3.3.2核型多角体病毒对甜菜夜蛾围食膜的影响在感毒后12、36和60h时，剖取对照组和处理组取食饲料的甜菜夜蛾幼虫各6头，剖取围食膜，用体视显微镜观察围食膜的变化。24 3.3.3甜菜夜蛾中肠组织石蜡切片的制备与染色在感毒后12、24、36、48、60和72h时，取对照组和处理组各时段甜菜夜蛾各6头，剖取中肠，制作石蜡切片。用0号昆虫针固定甜菜夜蛾幼虫头和尾部，背部朝上，一手拿尖头镊子夹住一侧表皮固定，另一手用镊子将昆虫表皮由头向尾沿着背部慢慢撕下，获得完整的中肠后，立即放入预冷PBS缓冲液（0.1mol/L，PH＝7）中漂洗，并用镊子小心剖离马氏管、丝腺等。在4℃卡诺氏（Carnoy）固定液中固定24h。固定后若来不及处理可用70%乙醇清洗2-3次后，放于70%乙醇中4℃保存。（1）脱水及透明将固定后的甜菜夜蛾中肠在室温下进行乙醇梯度脱水（75%，85%，90%，95%乙醇脱水45-70min，100%乙醇脱水40min）后，依次放入1/2二甲苯（二甲苯：无水乙醇=1：1）20min，二甲苯2次，各25min，进行透明处理，直至材料呈透明状。（2）浸蜡及包埋将透明处理后的组织先后迅速放入提前融化的1/2二甲苯的石蜡（石蜡50-52℃：二甲苯=1：1）和软石蜡（50-52℃）中浸蜡各1h，再重新浸入另一软石蜡1h。然后将融化好的硬石蜡（52-54℃）倒入提前做好标记的包埋框内，用镊子将浸蜡完全的组织放入包埋框中并摆放整齐。待石蜡自然凝固后，开始切片或放在4℃冰箱中备用。（3）切片与染色使用切片机将带有组织的蜡块进行切片（4μm）。将切好的蜡带进行分段后，放入温水中展片，然后用载玻片将其捞出并用滤纸吸去切片周围多余的水分。对载玻片进行标记，放入40℃的烘箱中烘片8h。将载玻片放入染色缸中脱蜡：二甲苯2次，各20min；1/2二甲苯5min；100%乙醇脱水2次各10min；依次95%，85%，75%乙醇各1次，分别7min；蒸馏水冲洗5min。在载玻片上滴加适量的苏木精染色3min，流水冲洗5min（水流不宜过大，避免将组织冲掉），1%盐酸乙醇浸泡10~30s，流水冲洗1min，PBS浸泡30s~1min，浸入95%乙醇5~10s，滴加适量的伊红染液，染色30s~2min，浸入95%乙醇5min，转浸入100%乙醇2次，各5min。在载玻片上滴1滴中性树胶封片剂，用镊子夹起盖玻片的一端，慢慢放在载玻片上，赶走气泡，干燥后在Leica生物显微镜下观[78、79]察，拍照。25 3.4结果与分析3.4.1核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫围食膜的影响A1A2A3A4图3-1核型多角体病毒对甜菜夜蛾幼虫围食膜的影响(15X)Fig.3-1TheeffectsofnucleopolyhedrovirusontheperitropHicmembrane(PM)ofSpodopteraexigua(15X)A1：空白对照组围食膜；A2：感毒后12h的围食膜；A3：感毒后36h的围食膜；A4：感毒后60h的围食膜A1:Control;A2:PMafter12hwithnucleopolyhedrovirus;A3:PMafter36hwithnucleopolyhedrovirus;A4:PMafter60hwithnucleopolyhedrovirus.甜菜夜蛾幼虫喂食核型多角体病毒后，在不同时间点解剖观察围食膜，发现围食膜结构发生了明显变化。对照组围食膜结构完整，无色透明，表面光滑，没有孔和缝隙，具有弹性，呈圆桶状（图3-1：A1）。感毒后12h时，围食膜结构完整，局部变成乳白色，仍然具有一定弹性（图3-1：A2）。感毒后36h时，围食膜全部变成乳白色，破裂成单片状，弹性降低（图3-1：A3）。感毒后60h时，围食膜破裂严重，变成乳白色无弹性碎片（图3-1：A4）。26 3.4.2核型多角体病毒对取食不同食物甜菜夜蛾中肠组织的影响由图3-2可知，取食饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的甜菜夜蛾，对照组中肠柱状细胞均为椭圆形，细胞排列紧密，围食膜清晰可见（图3-2：A1，B1，C1，D1），与处理组各时段相应日龄的正常甜菜夜蛾中肠组织切片均大致相同。取食饲料的甜菜夜蛾感毒后12h，中肠柱状细胞伸长，细胞开始变形，围食膜开始被破坏，但还能看见围食膜片段（图3-2：A2）；24h时围食膜破坏加剧，有囊泡产生，细胞排列开始混乱，部分细胞破裂，局部细胞核脱落（图3-2：A3）；36h时围食膜消失（图3-2：A4）；48h时细胞排列更加疏松混乱，看不清明显的细胞形态，细胞核脱落并开始向肠腔移动（图3-2：A5）；60和72h时甜菜夜蛾肠壁细胞大量破裂，脱落，囊泡继续膨胀，肠壁细胞明显变厚（图3-2：A6，A7）。取食黄豆的幼虫感毒后中肠组织的变化与取食饲料的变化类似，感毒后12h时中肠柱状细胞伸长，围食膜被破坏（图3-2：B2）；24h时有囊泡出现（图3-2：B3）；36h围食膜消失，细胞破裂，核脱落（图3-2：B4）。取食甘蓝的幼虫感毒后12h时中肠柱状细胞变为长椭圆形，围食膜仍然清晰可见（图3-2：C2）；24h时细胞排列开始混乱且顶端出现囊泡，围食膜被破坏，呈不连续状（图3-2：C3）；36h围食膜仍然存在（图3-2：C4）；48h围食膜破坏消失，细胞严重变形并且破裂，有核脱落的现象（图3-2：C5）；感毒后60和72h出现大量囊泡，脱落的细胞核向肠腔移动，肠壁细胞层变厚（图3-2：C6，C7）。取食蕹菜的幼虫感毒后12h时中肠柱状细胞开始伸长，围食膜清晰可见（图3-2：D2）；24h时细胞变形加重，但细胞排列相对整齐有序（图3-2：D3）；36h围食膜被破坏，呈半环状，有囊泡出现，细胞排列混乱，没有明显的细胞形态（图3-2：D4）；48h时围食膜破坏严重，但其碎片仍然可见，部分细胞破裂，核脱落（图3-2：D5）；60h时围食膜消失（图3-2：D6）；72h囊泡大量膨胀，细胞破坏严重，细胞核进入肠腔，肠壁细胞层变厚（图3-2：D7）。取食人工饲料和不同寄主植物的幼虫在感毒后中肠组织都发生了明显的变化，且存在显著时间差异。如表3-1所示，取食饲料或黄豆的幼虫感毒后12h时围食膜被破坏（图3-2：A2，B2；表3-1），而取食甘蓝和蕹菜的幼虫则在感毒后24和36h（图3-2：C3，D4；表3-1）。取食饲料或黄豆的幼虫中肠细胞在感毒后24h时顶端出现囊泡（图3-2：A3，B3；表3-1），取食甘蓝和蕹菜则在24和36h时出现囊泡（图3-2：C3，D4；表3-1）。取食饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的幼虫分别在感毒后24、36、48和48h出现细胞破裂（图3-2：A3，B4，C5，D5；表3-1），在感毒后36、36、48和60h时围食膜消失（图3-2：A4，B4,C5，D6；表3-1）。27 人工饲料artificialdiets黄豆Glycinemax甘蓝Brassicaoleracea蕹菜Ipomoeaaquatica50μmCC50μm50μm50μmPMCCPM对照PMCCControlCCPMA1B1C1D150μm50μm50μm50μmCCCCCCCC12hPMPMPMPMA2B2C2D250μm50μm50μm50μmVPMNVV24hPMPMPMA3B3VC3D328 人工饲料artificialdiets黄豆Glycinemax甘蓝Brassicaoleracea蕹菜Ipomoeaaquatica50μm50μm50μm50μmPMVV36hVVNVPMA4B4C4D4V50μm50μm50μm50μmPMV48hVNVNVA5B5C5VD550μm50μm50μm50μmVVV60hVA6B6C6D629 人工饲料artificialdiets黄豆Glycinemax甘蓝Brassicaoleracea蕹菜Ipomoeaaquatica50μm50μm50μm50μmVV72hVVA7B7C7D7图3-2取食不同食物的甜菜夜蛾感毒后中肠肠壁细胞的变化（400X）Fig.3-2ChangesinthemidgutcellsofSpodopteraexiguatreatedwithnucleopolyhedroviruswhentheyfeedondifferentfoods(400X)注：PM：围食膜；CC：柱状细胞；V：囊泡；NV：细胞核。A1：取食饲料的甜菜夜蛾对照组中肠组织，A2~A7：取食饲料的甜菜夜蛾感染病毒后12，24，36，48，60，72h的中肠组织；B1：取食黄豆的甜菜夜蛾对照组中肠组织，B2~B7：取食黄豆的甜菜夜蛾感染病毒后12，24，36，48，60，72h的中肠组织；C1：取食甘蓝的甜菜夜蛾对照组中肠组织，C2~C7：取食甘蓝的甜菜夜蛾感染病毒后12，24，36，48，60，72h的中肠组织；D1：取食蕹菜的甜菜夜蛾对照组中肠组织，D2~D7：取食蕹菜的甜菜夜蛾感染病毒后12，24，36，48，60，72h的中肠组织。Note:PM:Peritrophicmembrane;CC:Columnarcell;V:Vesicle;NV:Nucleus.A1:Control;A2~A7:ThemidgutofSpodopteraexiguafeedingonartificialdietsaftervirusinfectionof12,24,36,48,60,72h;B1:Control;B2~B7:ThemidgutofSpodopteraexiguafeedingonGlycinemaxaftervirusinfectionof12,24,36,48,60,72h;C1:Control;C2~C7:ThemidgutofSpodopteraexiguafeedingonBrassicaoleraceaaftervirusinfectionof12,24,36,48,60,72h;D1:Control;D2~D7:ThemidgutofSpodopteraexiguafeedingonIpomoeaaquaticaaftervirusinfectionof12,24,36,48,60,72h.30 表3-1取食不同食物的甜菜夜蛾感染核型多角体病毒后的中肠组织变化Table3-1ThechangesofmidguttissuesfromlarvalSpodopteraexiguafeedingondifferentfoodswhentheywereinfectedwithnucleopolyhedrovirus食物围食膜破坏出现囊泡细胞破裂围食膜消失foodsPMdestroyedVesiclesCellrupturePMdisappered饲料12h24h24h36hartificialdiets黄豆12h24h36h36hGlycinemax甘蓝24h24h48h48hBrassicaoleracea蕹菜36h36h48h60hIpomoeaaquatica3.5讨论昆虫中肠是分泌消化酶、消化食物和吸收营养物质的重要场所，同时也是有毒有害物质的作用靶标。本研究采用解剖观察法及组织切片法探究了核型多角体病毒对甜菜夜蛾中肠组织的影响，研究结果发现甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后，其中肠组织出现显著变化，中肠柱状细胞排列混乱，细胞变形伸长，围食膜被破坏或消失，这与赵晓峰等报道甜菜夜蛾感染病原菌（粘质沙雷氏菌PS-1菌）以及魏红爽等报道的暗黑鳃金龟幼虫取食Bt菌株HD8E和HD8G后出现的现象类似[80、81]。围食膜是作为昆虫抵御外源性病原微生物的入侵和维系昆虫正常生理代谢的[82、83]重要屏障，当其被破坏时，能够促进病原微生物对害虫的感染，可抑制害虫生长发育，加速其死亡，从而达到控制害虫种群的目的。因此，本研究中核型多角体病毒对甜菜夜蛾的杀虫作用很可能与其对昆虫围食膜的破坏有直接关系。此外，本研究还发现感染核型多角体病毒的甜菜夜蛾中肠柱状细胞变化较大，这可能是由于中肠柱状细胞位于肠壁细胞层的最外层，当围食膜遭到破坏后，柱状细胞发生变化，其微绒毛被破坏脱落，细胞由原来的椭圆形开始变形、伸长，顶端[84-86]出现囊泡，最后囊泡及细胞核移向肠腔。再生细胞位于肠壁细胞的基部受到的影响较小，为了弥补被破坏的细胞，再生细胞会打破其原有分裂周期，提前快31 速分裂但不分化，导致细胞层局部变厚，致使肠壁细胞分泌消化酶和营养吸收的[87]功能受损，最终导致感毒昆虫发育迟缓甚至死亡。因此，本研究初步说明核型多角体病毒的杀虫机理是通过破坏甜菜夜蛾的围食膜和上皮细胞。但是该病毒是如何导致甜菜夜蛾围食膜破坏和上皮细胞破裂的具体分子机理还不清楚，需要更进一步的研究。本研究还发现取食人工饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的甜菜夜蛾幼虫感毒后其中肠组织都受到不同程度的破坏，且存在明显的时间差异。取食饲料和黄豆的甜菜夜蛾在感毒后受到病毒的影响最大且类似；取食甘蓝的甜菜夜蛾受病毒影响次之；取食蕹菜的受病毒影响最小。这与本研究第二章中关于植物种类调节甜菜夜蛾对核型多角体病毒易感性的研究结果相一致：取食黄豆的夜蛾对核型多角体病毒的[6]易感性较强，而取食蕹菜、甘蓝易感性较弱。以往研究也证实植物种类可对甜菜[88、89]夜蛾的生长发育、存活率以及生殖力等产生显著影响。因此，植物种类是影响甜菜夜蛾对核型多角体病毒易感性的一个不容忽视的重要因素。产生这种现象的原因有很多，一方面可能是与不同植物种类叶片中含有的化学物质种类存在差异有关。有研究表明，植物叶片中的化学物质能抑制或提高病毒在昆虫宿主肠道[90、91]中的感染力，进而影响昆虫对病毒的易感性。也有可能是昆虫取食不同植物后，植物叶片的损伤或昆虫的口腔分泌物诱导产生不同程度的信号，进而产生不[92]同的次级代谢物或有毒物质，对昆虫造成不同程度的伤害。事实上，植物叶片影响昆虫对病毒的易感性，这是植物中所有物质综合调节的结果。在植物叶片中的众多化学物质中到底哪些物质能增强或削弱这种易感性，到目前为止，还没有统一答案。但实践证明，病毒经多酚类植物（如棉花、甘蓝和花椰菜）感染昆虫[9、93]后，昆虫对病毒的易感性往往较低，而经寡酚类植物（黄豆、玉米和番茄）[94]感染昆虫后，昆虫对病毒的易感性则增强。另一方面，也有可能与植物中含有化合物的含量有关，某种或某些化合物含量在达到一定程度时可能才发挥调节昆虫免疫、抵御外界病原物的作用；又或者昆虫对植物中同种化合物的吸收程度不同，进而导致昆虫在遇到外界病原物时的易感性和免疫能力不同。但是这些化学物质影响昆虫对病毒易感性的具体机制还不清楚，需要进一步的研究与探讨。核型多角体病毒造成中肠组织病变是引起甜菜夜蛾致死的重要原因之一，它能够破坏作为昆虫第一道物理保护屏障的围食膜。因此，可利用该作用特性研制绿色、高效的新型生物杀虫剂。将植物–植食性昆虫–昆虫病原微生物三者之间的互作关系应用到农业害虫防治中，并利用取食不同寄主植物的甜菜夜蛾对病毒易感性的差异指导农业实际生产中的具体操作，调节不同农作物施用新型生物杀虫剂的剂量，进而避免浪费、节约成本，综合提高生物防治效果。32 第四章取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后围食膜超微结构的变化4.1实验材料甜菜夜蛾，SeMNPV及植物来源见第二章2.1。4.2试剂与器材主要试剂及其配制：无水乙醇，25%戊二醛均购自国药。2.5%戊二醛：25%戊二醛：PBS（0.2mol/L）：蒸馏水=1：5：4的比例进行配，4℃保存。实验器材：EMCPD300干燥仪（德国莱卡），JSM-6380LV扫描电镜（JEOL），MC1000离子溅射仪（日立高新）。4.3试验方法4.3.1试虫感毒处理6-1用微量进样器滴1µL浓度为1.120×10OBs·mL的病毒液于叶片和人工饲料上，其他处理方法同第二章2.3.1。对照组和处理组重复3次，每重复42头幼虫。4.3.2取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染病毒后围食膜超微结构的观察甜菜夜蛾在感毒后1，2，3，6，12，24和48h时分别剖取对照组和处理围食膜，并将获得的围食膜立即放入2.5%戊二醛中固定，固定后用PBS冲洗。然后依次用30%，50%，70%，85%，95%，100%乙醇进行梯度脱水，各浓度均处理20min。将梯度脱水后的围食膜经CO2临界点干燥仪干燥后，用镊子小心的粘在事先做好标记并贴有黑色导电胶的样品台上，将样品台放入离子溅射仪内进行喷金7~8min。最后观察并拍照。33 4.4实验结果取食饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的对照组甜菜夜蛾幼虫围食膜结构完整，均具有褶皱，没有孔洞和缝隙（图4-1：A1，B1，C1，D1）。感毒后1h时，取食饲料的幼虫围食膜出现孔洞，而取食黄豆、甘蓝和蕹菜的围食膜没有明显变化，无孔洞出现（图4-1：A2，B2，C2，D2）；感毒后2h时，取食饲料的幼虫围食膜未能观察到明显的孔洞，恢复原状（图4-1：A3），取食黄豆和甘蓝的幼虫围食膜遭到破坏，出现孔洞和缝隙，并且取食黄豆的孔洞和缝隙较明显（图4-1：B3，C3），取食蕹菜的围食膜并没有明显变化（图4-1：D3）；感毒后3h时，取食饲料的围食膜又被破坏，重新出现了孔洞（图4-1：A4），取食黄豆的幼虫围食膜比感毒后2h时破坏程度减弱，孔洞变小（图4-1：B4），取食甘蓝的围食膜破坏程度比感毒2h时严重，孔洞变大（图4-1：C4），取食蕹菜的围食膜出现破坏，有孔洞出现（图4-1：D4）；感毒后6h时，取食饲料和黄豆的围食膜破坏程度均比感毒3h时严重，且取食饲料的破坏程度较取食黄豆的严重（图4-1：A5，B5），取食甘蓝的围食膜破坏程度减轻，孔洞变小（图4-1：C5），取食蕹菜的围食膜损害加剧，孔洞变大（图4-1：D5）；感毒后12h时，取食饲料，黄豆和甘蓝的围食膜破坏程度均比感毒6h严重，围食膜破坏程度饲料>黄豆>甘蓝（图4-1：A6，B6，C6），取食蕹菜的围食膜比上个时间点破坏程度减弱，孔洞变小（图4-1：D6）；感毒后24h时，取食蕹菜的围食膜破坏程度加重（图4-1：D7），取食饲料，黄豆和甘蓝的围食膜破坏程度均比上个时间点加重且依次减弱（图4-1：A7，B7，C7）；感毒后48h时，取食饲料围食膜质地变脆，孔洞最大，破坏程度最严重，取食黄豆，甘蓝和蕹菜的围食膜破坏程度依次减弱（图4-1：A8，B8，C8，D8）。取食饲料的甜菜夜蛾在感毒后1h时，围食膜遭到破坏，出现孔洞，2h时围食膜恢复，未能观察到孔洞，而在3，6和12h时围食膜的被破坏程度依次加重，表明取食饲料的幼虫在感毒后2h时围食膜发生修复；取食黄豆的甜菜夜蛾在感毒后1h和2h时围食膜破坏程度依次加重，3h时相对减弱，6h和12h时又依次加重，表明取食黄豆的幼虫在感毒后3h时出现修复；取食甘蓝的幼虫在感毒处理后前3h围食膜破坏程度依次加重，6h时破坏程度减弱，12h时围食膜破坏程度又加重，表明在感毒后6h时取食甘蓝的幼虫围食膜发生修复；取食蕹菜的幼虫在感毒处理后前6h围食膜破坏程度依次加重，12h时破坏程度减弱，24h时破坏程度又加重，表明取食蕹菜的甜菜夜蛾在感毒后12h时围食膜发生修复。由此可得出取食饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的昆虫围食膜出现孔洞的时间分别为感毒1h，2h，2h，3h，孔洞修复的时间为感毒后2h，3h，6h，12h（表4-1）。34 人工饲料artificialdiets黄豆Glycinemax甘蓝Brassicaoleracea蕹菜Ipomoeaaquatica对照ControlA1B1C1D11hA2B2C2D22hA3B3C3D335 人工饲料artificialdiets黄豆Glycinemax甘蓝Brassicaoleracea蕹菜Ipomoeaaquatica3hA4B4C4D46hA5B5C5D512hA6B6C6D636 人工饲料artificialdiets黄豆Glycinemax甘蓝Brassicaoleracea蕹菜Ipomoeaaquatica图5-1核型多角体病毒对取食不同食物资源甜菜夜蛾围食膜超微结构的影响24hFig.5-1TheeffectofnucleopolyhedrovirusonthePMµLtrastructureofSpodopteraexiguawhentheyfeedondifferentfoodresourcesA7B7C7D748hA8B8C8D8图4-1核型多角体病毒对取食不同食物甜菜夜蛾围食膜超微结构的影响（5000X）Fig.4-1TheeffectofnucleopolyhedrovirusontheutrastructureofthePMofSpodopteraexiguatreatedwithwhentheyfeedondifferentfoods(5000X)A1：取食饲料的对照组围食膜超微结构，A2~A8：取食饲料甜菜夜蛾感染病毒后1，2，3，6，12，24，48h的围食膜超微结构；B1：取食黄豆的对照组围食膜超微结构，B2~B8：取食黄豆甜菜夜蛾感染病毒后1，2，3，6，12，24，48h的围食膜超微结构；C1：取食甘蓝的对照组围食膜超微结构，C2~C8：取食甘蓝甜菜夜蛾感染病毒后1，2，3，6，12，24，48h的围食膜超微结构；D1：取食蕹菜的对照组围食膜超微结构，D2~D8：取食蕹菜甜菜夜蛾感染病毒后1，2，3，6，12，24，48h的围食膜超微结构。A1:Control;A2~A8:ThePMultrastructureofSpodopteraexiguafeedingonartificialdietsaftervirusinfectionof1，2，3，6，12，24，48h;B1:Control;B2~B8:ThePMultrastructureofSpodopteraexiguafeedingonGlycinemaxaftervirusinfectionof1，2，3，6，12，24，48h;C1:Control;C2~C8:ThePMultrastructureofSpodopteraexiguafeedingonBrassicaoleraceaaftervirusinfectionof1，2，3，6，12，24，48h;D1:Control;D2~D8:ThePMultrastructureofSpodopteraexiguafeedingonIpomoeaaquaticaaftervirusinfectionof1，2，3，6，12，24，48h.37 表4-1取食不同食物的感毒甜菜夜蛾幼虫围食膜出现孔洞与孔洞修复的时间点比较Table4-1ComparisonofthetimepointsofholeandholerepairfromlarvalSpodopteraexiguafeedingondifferentfoodswhentheywereinfectedwithnucleopolyhedrovirus14出现孔洞时间12孔洞修复时间10）86感毒后时间4Timeoftoxicity（20饲料黄豆甘蓝蕹菜4.5讨论根据前一章研究内容，我们发现核型多角体病毒可显著影响甜菜夜蛾的中肠组织，同时围食膜的完整性也遭到了破坏，并且取食不同植物的幼虫，其围食膜的破坏程度不同。为了进一步了解病毒对取食不同食物的甜菜夜蛾围食膜结构的影响，本章将借助扫描电镜技术探究取食不同寄主植物的甜菜夜蛾感毒前后中肠围食膜表面结构特征的差异。通过超微结构观察发现感染病毒后，取食不同食物的幼虫围食膜遭到破坏后均具有一定的修复功能。刘博等研究发现家蚕感染病毒后也存在围食膜修复现象[95]。这种现象可能与昆虫的自我保护机制有关，以往研究也证实当昆虫围食膜被破坏到一定程度时，位于肠壁组织基部受病毒影响较小的再生细胞会替补修复已[85]经损害的肠壁细胞，使围食膜逐渐得到修复。与此同时，研究结果还发现取食饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的甜菜夜蛾感毒后其围食膜修复时间点存在显著差异，分别是感毒后2，3，6和12h，并且幼虫围食膜的破坏程度依次减弱。这一研究结果与前两章研究结果（植物种类调节甜菜夜蛾对病毒的易感性及取食不同寄主植物的甜菜夜蛾感染病毒后中肠组织的变化）相吻合。此外，围食膜作为昆虫抵御[96、97]外源性病原微生物的入侵和维系昆虫正常生理代谢的重要屏障，当其被破坏38 时，能够加速外界病菌对害虫的侵染，可抑制害虫的生长发育，加速其死亡。因此，核型多角体病毒对幼虫围食膜结构的影响是导致宿主对病毒易感性差异的重要原因之一。然而该病毒是如何破坏围食膜表面结构的具体分子机理，还需要进一步深入的研究。病毒对取食不同寄主植物的甜菜夜蛾围食膜结构的破坏作用存在差异，可能原因是不同植物中化学物质的种类和含量有所不同。在植物体内的众多化合物中，可能有某种或某些化合物影响了围食膜再生细胞的活性，导致围食膜的修复能力受限；也有可能病毒中某些酶活性受到了化合物的抑制，导致病毒对围食膜的破坏作用增强或减弱；亦或者影响了昆虫肠液中的蛋白酶活性，从而抑制了对围食[98]膜的修复作用。研究显示，芸香苷（rutin）、绿原酸（chlorogenicacid）、水解[99][71]丹宁（Hydrolysabletannin）和饮食丹宁（dietarytannis）等酚类物质可降低昆虫对病毒的易感性。而对于该类化合物如何调控昆虫对病毒的易感性，是否参与破坏昆虫围食膜结构及其他化学物质是否参与，还有待进一步探讨。39 第五章甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒前后中肠转录组的构建转录组指生物体内的组织或细胞在某一条件下所转录RNA的总和，主要是指[100、101]mRNA。高通量测序的出现使分析物种的转录组和基因组成为可能。中肠作为昆虫的免疫组织，也是用来研究昆虫与病毒互作关系的重要器官。有报道显[102]示家蚕浓核病毒感染家蚕前后，构建的中肠基因文库发现有151条基因发生了[103]差异表达。刘晓勇等通过病毒感染高抗和高感家蚕，发现中肠中可能有5个免疫相关蛋白。在本研究中，我们利用Illumina/Solexa新一代测序技术，构建了感毒和未感毒的甜菜夜蛾中肠转录组，并且对转录组进行了分析。预实验中，在甜菜夜蛾感毒后4、24、48、72h时，我们分别剖取感毒和未感毒幼虫中肠，进行转录组构建，发现感毒后48h是出现差异基因最多的时间点，并且对其进行重复试验。这些数据为下一步研究甜菜夜蛾中肠组织对核型多角体病毒的免疫提供了理论支持。5.1实验材料甜菜夜蛾，SeMNPV来源见第二章2.1。5.2试剂与器材主要试剂：RNA6000Nanokit，AgilentHighSensitivityDNAKit购自Agilent；P7589Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit购自Invitrogen。实验器材：NC2000Nanodrop（ThermoScientific），E6090TBS380荧光计（Promega），DYY-6C电泳仪（北京六一），2100Bioanalyzer（Agilent）。40 5.3实验方法5.3.1试虫感毒处理6-1用微量进样器滴1µL浓度为1.120×10OBs·mL的病毒液于人工饲料上，其他处理方法同第二章2.3.1。对照组和处理组重复3次，每重复10头幼虫。甜菜夜蛾感毒后48h时，分别剖取感毒和未感毒幼虫中肠，样本数均为3。中肠收集完成后放入液氮冷冻，然后-80℃保存。5.3.2cDNA的构建和Illumina测序图5-1技术路线Fig.5-1Technicalroute用Trizol法提取48h未感毒（48hW）和48h感毒（48hD）的甜菜夜蛾中肠的总RNA。从RNA的提取到测序的技术路线如图5-1。链特异性文库的构建如图5-2。其具体步骤：利用Oligo(dT)磁珠对mRNA41 进行富集、纯化。借助离子打断方法，将mRNA片段化为200-300bp的小片段。以小片段的mRNA为模板，在6碱基随机引物和逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，第二链的cDNA碱基T被替换成U，3’端加上A完成cDNA末端修复，并且利用磁珠对其进行筛选。通过PCR选择300-400bp的cDNA。然后检测文库大小和总浓度，将构建好的文库，进行双末端（Paired-end，PE）测序。图5-2链特异性文库构建示意图Fig.5-2Constructionofchainspecificlibrary5.3.3数据整理及转录本的拼装与分析原始数据（RawReads）除去接头序列、不确定核苷酸和低质量Reads后，过滤生成高质量数据（CleanReads）。[104]借助Grabherr方法将得到的CleanReads用Trinity软件对感毒和未感毒的中肠组织进行转录组的拼接。Trinity软件由Inchworm，Chrysalis和Butterfly组成：Inchworm将K-mer长度的短序列库进行延伸，将Reads组装为Contigs；Chrysalis将Contig进行聚类，并且将每个聚类构成DeBruijnGraph，Butterfly处理Chrysalis构成的Bruijn图，并且得到转录本（图5-3）。Trinity最初拼接结果为Contig序列，最42 终得到的转录本为Transcript，最后将结果统计分析。图5-3Trinity软件从头拼接组装基本流程Fig.5-3OverviewofTrinitysoftwarefordenovoassembly5.3.4Unigene基因功能注释[105][106][107]对聚类得到的unigene基因与NR、GO、KEGG、eggNOG、Swiss-Prot等公共数据库进行比对，获取与unigene基因的本物种或相似度较高的近源物种序列，获得该unigene基因的注释信息。一个unigene可以共同注释到多个数据库中，在不同的数据库中注释信息有很大的差异。5.3.5Unigene表达差异分析[108]利用RSEM软件计算转录组中基因的表达定量。以拼接而成的转录本为参考，首先将感毒和未感毒中肠CleanReads比对到转录本序列上。然后统计基因上的Reads数量，计算出FPKM值。最后比较处理前后中肠的FPKM密度分布情况。样品的处理不同（感毒和未感毒甜菜夜蛾），基因的表达量可能也不相同，可以分为上调和下调基因。在分析表达差异unigene时需要同时满足43 |log2(FoldChange)|>1且P-value<0.05，其中FoldChange和P-value分别表示表达量的倍数变化及变化显著性。当一个基因同时满足时，则为差异表达基因（differentiallyexpressedgene,DEG），然后进行GO和KEGG富集分析。5.4结果分析5.4.148hD和48hW中肠RNA的质量检测48hD和48hW中肠RNA样品紫外检测结果如表5-1，48hD和48hW的紫外分光光度计检测OD260/280均接近1.8，每个样品检测结果均合格。凝胶电泳检测（图5-4）主带明显，无降解，没有拖尾现象，符合转录组建库要求。M：从上到下分别依次为2000、1000、750、500、250、100bp；1，2，3泳道分别为48hD1，48hD2，48hD3；4，5，6泳道分别为48hW1，48hW2，48hW3。图5-4甜菜夜蛾48hD和48hW中肠RNA电泳图Fig.5-4ElectrophoresisresultsofRNAfrom48hDand48hW44 表5-1中肠RNA的质量检测Table5-1QualitydetectionofRNAinthemidgut样品名称浓度(ng/μl)OD260/280体积(μl)总值(μg)结果sampleconcentrationOD260/280volume(μl)totalvalueConclusion48hD1212.901.9760.0012.77合格48hD294.601.7590.008.51合格48hD3173.301.8890.0015.60合格48hW1191.001.97100.0019.1合格48hW298.601.7690.008.87合格48hW376.901.7690.006.92合格5.4.2原始数据的输出及过滤7经过Illumina测序，48hD和48hW得到Reads的平均数分别为4.406×10条，7774.305×10条。CleanReads的平均数为4.346×10条和4.248×10条，分别占RawReads的98.65%和98.66%。未知不确定碱基低于0.006%，Q30（准确率大于99.9%的碱基比例）平均值分别为90.91%和90.85%，Q20（准确率大于99%的碱基比例）的百分比均在95%以上，GC占碱基的平均百分比分别为45.18%和46.11%。表5-248hD和48hW测序原始数据输出及过滤统计表Table5-248hDand48hWsequencingrawdataoutputandfilteringstatisticsSampleReadsCleanReadsCleanN(%)Q20(%)Q30(%)GC(%)Num.No.Reads%.48hD141,832,51441,389,79098.9410.00401497.593.845.4648hD243,787,58643,185,35098.620.00551395.689.9145.2448hD346,562,58045,814,87298.390.00467395.1289.0344.8648hW144,070,77843,620,32298.970.00389497.1593.147.2248hW241,860,77041,206,61098.430.0052195.2989.3345.0048hW343,222,01042,613,60698.590.00193495.790.1346.1345 5.4.3序列的拼接组装利用Trinity软件对48hD和48hWCleanReads拼接成转录本。其中Contig有174,177条，Transcript有96,647条，Unigene有74,066条，Transcript和Unigene的序列平均长度分别为885.84bp，673.82bp，而Contig的序列平均长度为389.08。Contig，Transcripts和Unigene的N50分别为650bp，1902bp，1363bp，N90分别为156bp，290bp，248bp。Contig中长度大于N50和N90的序列总数分别为18,197条，121,832条（N50/N90bp：所有序列按照由长到短依次相加，直到累加长度占总长度50%/90%时，最后一条的长度），Transcript则为12,576条，60,670条，Unigene的数量分别为8,813条，51,701条（如表5-3）。表5-3拼接结果统计Table5-3ResultsstatisticsofsplicingassemblyContigTranscriptUnigeneTotalLength(bp)67,768,84285,613,32949,906,814SequenceNumber174,17796,64774,066Max.Length(bp)24,41720,56420,564MeanLength(bp)389.08885.84673.82N50(bp)6501,9021,363N50SequenceNo.18,19712,5768,813N90(bp)156290248N90SequenceNo.121,83260,67051,701GC%39.1439.9839.205.4.4甜菜夜蛾Unigene功能注释将74,066条unigene比对到NR，GO，KEGG，eggNOG和Swissprot等5种数据库，注释结果见表5-4。有3,265条unigene在5种数据库均得到注释，占4.41%。在NR中有25,398条unigene被注释，在5种数据库的百分比最高，占34.29%；有5,526条注释到KEGG，占5种数据库的百分比最少7.46%。对甜菜夜蛾中肠48hD和48hW的unigene比对注释结果进行物种分布（图5-5），柑橘卷叶蛾（Amyeloistransitella）基因所占百分比最高为19%，家蚕（Bombyxmori）所占百分比次之，为15%。甜菜夜蛾中肠48hD和48hW的unigene在NR中比对结果的E值分布（图5-6），46 e-value=0的百分比最高，占19%。1e-60~1e-45的unigene所占的百分比最低为8%。unigene的E值为0~1e-100为13%，1e-100~1e-60占总比例的12%，1e-15~1e-30，1e-45~1e-30，1e-5~1e-15的unigene所占比例分别为18%，14%，16%。甜菜夜蛾的unigene比对注释结果的Identity分析（图5-7），相似度60%~80%之间所含比例最高为32%，相似度在40%以下的比例最低为4%，相似度为40%~60%占总数的23%，unigene相似度为80%~95%，95%~100%分别占总数26%，14%。综合分析表明序列同源性较高，注释结果具有相当的可靠性。表5-4甜菜夜蛾unigene基因注释结果统计Table5-4StatisticsofunigeneannotationofSpodopteraexiguaAnnotationinDatabaseUnigeneNo.Percentage(%)NR25,39834.29GO11,58415.64KEGG5,5267.46eggNOG23,26331.41Swissprot17,55823.71Inalldatabase3,2654.41图5-5甜菜夜蛾的unigene比对注释结果的物种分布Fig.5-5DistributionofspeciesinunigeneannotatedresultsofSpodopteraexigua47 图5-6甜菜夜蛾的unigene在NR中比对注释结果的E值分布Fig.5-6TheEvaluedistributionofBlastresultsofunigeneannotatedinNRdatabase图5-7甜菜夜蛾的unigene在NR中比对注释结果的Identity分布Fig.5-7TheNRIdentitydistributionofunigeneannotatedinNRdatabase48 5.4.5甜菜夜蛾Unigene的GO分类[109]甜菜夜蛾11,584个unigene借助BLAST2GO软件来完成GO注释。GO的基本单元是Term，GO总共有三类：分子功能（MF）、细胞组分（CC）、生物学过程（BP）。从GO分类注释结果可知（图5-8）：参与生物学过程有24个Term，其中细胞过程（5566）基因数目最多，占总数的比例最高48.05%，其次是参与代谢过程（5049）的unigene，占43.59%，参与单一的生物过程（4274）的unigene所占百分比为36.9%。参与细胞组分的有24个Term，其中关于细胞（4024）所占比例较高，为34.74%，类核（9）的unigene数目最少占总数的0.08%。属分子功能的有19个Term，其中关于结合（5611）和催化活性（5052）的基因数目较高，分别为占总数的48.44%，43.62%。此外，在生物学过程中有关于免疫系统的过程的term有243条unigene，占2.1%。图5-8GO分类注释结果Fig.5-8GOclassificationannotationresults49 5.4.6甜菜夜蛾Unigene的EggNOG分类对23,263个unigene进行eggNOG比对注释，将每一个unigene归类到eggNOG分类目录上，eggNOG分类注释的数据统计结果如图5-9，eggNOG的注释为26个分类，参与一般功能预测（7,754）的unigene数目最多，占总数的10.47%。与信号转导机制（2,953）有关的unigene占3.99%。其中参与翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣（1,771）和转录（1,439）的unigene分别占总数的2.39%，1.94%。参与复制、重组和修复（1,015）和翻译、核糖体结构和生物合成（1,007）的unigene数目接近，各占总数的1.37%，1.36%。此外，未知功能（6,044）的unigene数目占总数8.16%，未知功能的基因中可能含有一些还未被人类发现的新基因。图5-9EggNOG功能注释分类图Fig.5-9EggNOGfunctionalannotationclassification5.4.7甜菜夜蛾Unigene的KEGG分类甜菜夜蛾5,526条具有KEGG注释的unigene，可分为5大类：细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢和有机系统。与代谢过程有关的unigene数目最多为1539条，其中参与碳水化合物代谢的有250条unigene，参与脂质代谢和氨基酸代谢50 的unigene数目分别为218条，167条。参与有机系统的unigene数目次之为1233条，环境信息处理的unigene数目最少为983条，细胞过程和遗传信息处理的unigene数目分别为795条，656条。在KEGG代谢的子类别中有信号传导、信号分子及其相互作用，细胞生长与死亡和免疫系统有关的基因序列，分别有553条，85条，214条，195条，它们其中的某些序列可能在甜菜夜蛾抵御核型多角体病毒中发挥了一定的作用。图5-10KEGG注释统计图Fig.5-10KEGGannotationstatistics5.4.8RNA-Seq整体质量评估5.4.8.1Unigene表达量密度分布对48hW和48hD中肠的FPKM密度分布是利用Density函数估算得出。从图5-11可看出低表达（占小部分），中等表达（占绝大多数）和高表达（占小部分）基因的分布。51 图5-1148hD和48hW各样品FPKM密度分布图Fig.5-11FPKMdensitydistributionof48hDand48hWsamples5.4.8.2样品相关性检验首先需要检查各个样品的相关性，再进行基因的差异分析。样品间相关系数越高（最高为1），表示其表达模式越相近，说明实验的实施性较高。若样本为生物学重复，其相关系数太低则会导致分析错误。该实验对48hW和48hD分别进行了三次生物学重复，48hW间的相关系数分别为0.85，0.75，0.68，48hD间的相关系数分别为0.89，0.73，0.71，其数目均较高，说明这两组内具有较小的差异。48hD和48hW相关系数较低，表示感毒前后的基因表达量具有较大的差异。52 图5-12样品间相关性检验Fig.5-12Correlationtestbetweensamples5.4.9甜菜夜蛾Unigene表达差异检测48hW和48hD样品经过筛选（同时满足|log2(FoldChange)|>1&P-value<0.05）发现有1785个差异基因，其中上调935个基因，下调850个基因（如表5-5）。将unigene的FoldChange值和P-value值的关系表现在同一图中，直观的体现出基因表达差异的分布，制作出火山图（VolcanoPlot）（图5-13）和MA图（图5-14）。火山图和MA图中红色和蓝色圆点分别表示符合/不符合表达差异的unigene，火山图左边和右边的红色圆点分别为48hW/48hD表达上调的基因，从MA图可知样本间基因的表达倾向与表达量无关。火山图中竖线表示差异阈值为-2和2倍，横线为P-value的阈值为0.05。MA图横坐标为表达强度，计算公式：（log2（样品Aunigene1的表达量×样品Bunigene1的表达量））/2；纵坐标为P-value值取10的对数。53 表5-5基因表达差异分析结果统计Table5-5StatisticalanalysisofdifferentialexpressionofgeneexpressionControlCaseUp-regulatedDown-regulatedTotalDEUnigeneUnigeneUnigene48hW48hD9358501,785图5-13VolcanoPlotFig.5-13VolcanoPlot54 图5-14MAPlotFig.5-14MAPlot5.4.10基因的GO富集分析对差异基因进行GO富集分析，得到681个DEG，11584个基因被注释到生物过程，细胞构成，分子功能。生物过程中，DEG主要富集到代谢过程（47.3%），细胞过程（36.0%），单一的生物过程（32.0%），有机物代谢过程（33.2%）；细胞构成中，主要富集到细胞膜（27.3%），细胞（24.8%），细胞组成（24.7%），细胞内液（24.4%）；分子功能中，其主要富集到催化活性（47.7%），结合（39.6%），离子结合（24.7%），有机环状化合物结合（23.9%），杂环化合物的结合（23.9%）。5.4.11基因的KEGG的富集分析在KEGGPathway的不同层级上统计分析筛选出的表达差异unigene数目，直观地分析DEG参与的主要代谢途径和信号转导通路。通过KEGG分析发现，DEG数目一共有637条，它与185条Pathway相对应，其中有303条上调基因对应到246条Pathway，334条下调基因对应到282条Pathway。Pathway通路可以分为4类：细胞进55 程14个，环境信息处理30个，遗传信息处理17个，新陈代谢78个，有机系统46个。上调基因富集到核糖体33条，真核生物核糖体合成29条，富集到嘌呤代谢和嘧啶代谢分别为11，10条；下调基因主要富集到氨基酸生物合成11条，长寿调节途径有11条，内质网蛋白质加工有10条，过氧化物酶体有8条（图5-15）。图5-15KEGG富集分析Fig.5-15EnrichmentanalysisofKEGG注：纵坐标表示条目；横坐标表示RichFactor，圆点的越大表示注释到该通路的差异基因越多，颜色表示差异基因所在通路的p值。5.5讨论甜菜夜蛾核型多角体病毒能够特异性的感染甜菜夜蛾，病毒通过昆虫取食进入虫体，在中肠内进行原发性感染，因此本研究选取昆虫的中肠作为试验材料。甜菜夜蛾中肠经过测序分析结果显示，48hD和48hW的RawReads经去除带接头、7低质量的Reads及不确定碱基后，生成的CleanReads平均数分别为4.346×10条和74.248×10条。拼接组装后得到的unigene基因有74,066条，丰富补充了甜菜夜蛾基56 因的数据库。Unigene基因在5种数据库中比对发现，有3,265条在5种数据库均得到注释，进一步丰富了基因功能。GO分类注释中参与的生物学过程，有24个Term，24200个基因，其中参与细胞过程的unigene数目为5566条，占总数的48.05%；参与细胞组分的有24个Term，24492个基因，关于细胞的unigene数目为4024条，占总数的34.74%；参与分子功能的有19个Term，13322个基因，其中关于结合功能的基因有5611条，占总数的48.44%。Unigene注释到KEGG的有5,526条，参与代谢的unigene数目最多为1539条，主要包括碳水化合物、脂质和氨基酸的代谢等。参与有机系统有1233条，主要包括内分泌系统，免疫系统等。环境信息处理为983条，包括信号转导，膜转运等。细胞过程为795条，包括运输和代谢，细胞生长与死亡等。遗传信息处理为656条，主要包括信号转导，翻译等。通过对48hW和48hD样品进行表达差异分析发现，有1785个差异基因，其中上调935个，下调850个。差异基因经GO富集分析发现，有681个DEG，11584个基因被注释到不同的子类别中。经KEGG富集分析，DEG数目一共有637条，它与185条Pathway相对应，其中有303条上调基因参与了246条Pathway，334条下调基因参与到282条Pathway。上调基因可能是甜菜夜蛾为应对病毒入侵做出的免疫防御，下调基因的可能原因是昆虫体内的大分子合成受到阻碍，利于病毒增殖。这些结果为甜菜夜蛾的肠道免疫机理的研究奠定了理论根基。[110-112]科研人员对不仅对甜菜夜蛾的生理特性及防治有大量报道，且对核型多[113、114]角体病毒对夜蛾生长发育的影响也有大量文献记载，但是病毒与昆虫作用的分子机理却鲜有报道。通过高通量测序技术构建了感毒和未感毒的甜菜夜蛾中肠转录组，通过对unigene序列分析发现，昆虫在感毒后体内基因的表达量进行上调或下调，基因的功能表达发生改变，虫体内出现了复杂的基因调控现象，说明甜菜夜蛾感染病毒后中肠的生理和病理均发生了变化，本研究为昆虫和病毒二者之间互作关系的分子机制奠定了基础。57 第六章取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后中肠功能基因的表达量分析昆虫肠黏蛋白（insectintestinalmucin,IIM）能够结合几丁质，具有O–联糖基化结构，它可维持围食膜的致密性并保护中肠免受外界病原微生物的侵害。昆虫几丁质酶（chitinase）是一种存在于昆虫不同生长时期及组织中的糖蛋白，它可以降解昆虫体壁、更新围食膜，在维持昆虫正常生长和发育中扮演着重要角色。在上一章的差异基因表达分析中，我们发现中肠肠黏蛋白和几丁质酶基因表达量有显差性异著，说明肠黏蛋白和几丁质酶是其重要的功能基因。为了明确中肠肠黏蛋白和几丁质酶在其生长发育过程中的作用，我们采用RT-PCR技术对其功能进行分析和验证。6.1实验材料甜菜夜蛾，SeMNPV及植物来源见第二章2.1。6.2试剂与器材主要试剂：柱式动物组织RNA抽提生化试剂盒购自上海生工，HiFiRTKitHiFi反转录试剂盒，2×SYBRGreenqPCRMix，1538RoxReferenceDye购自北京博凌科为生物科技有限公司。实验器材：Neofuge1600R高速冷冻离心机（力康），StepOnePlusReal-timePCRSystem（AppliedBiosytems）。6.3实验方法6.3.1试虫感毒处理6-1用微量进样器滴1µL浓度为1.120×10OBs·mL的病毒液于叶片和人工饲料上，其他处理方法同第二章2.3.1。对照组和处理组重复3次，每重复10头幼虫。感毒后58 4，12，24和48h时，分别剖取感毒和未感毒完整中肠，放入预冷的PBS（0.1mol/L，PH=7）中进行漂洗，收集中肠，液氮冷冻，然后-80℃保存。6.3.2中肠免疫基因的筛选依据高通量测序的结果和NCBI数据库，用DNAMAN软件对相关序列进行比对分析，筛选甜菜夜蛾幼虫中肠组织的功能基因。6.3.3荧光定量引物合成表6-1引物序列Table6-1Primersequences引物名称Primername序列SequencesSe-β-actin-FATCCTCCGTCTGGACTTGGSe-β-actin-RCGCACGATTTCCCTCTCASe-IM-FAACGGAACTGACAACGATASe-IM-RCACAGGGGCTCACAACTTSe-CS-FGCCATGTGCTTCATACCTSe-CS-RAGAACACTGTTGCCGTTTA6.3.4中肠RNA提取1．向各时间点的感毒和未感毒甜菜夜蛾中肠中，加入450μL的BufferRlysis-AG进行充分研磨，震荡2min，然后静置3min。2.12000rpm，4℃，离心3min，用移液枪吸取上清液放置在1.5mL的RNase-free离心管中。3.加入1/2体积的无水乙醇，并混合均匀。4.将混合液全部移到带有收集管的吸附柱中，室温放置1min，12000rpm，离心1min，倒掉废液。5.将500μLGT溶液（已添加一定百分比的无水乙醇）加入到吸附柱中，室温放置1min，10000rpm，离心1min，倒掉废液。6.将500μLNT溶液（已添加一定百分比的无水乙醇）加入到吸附柱中，室温放置2min，10000rpm，离心1min，倒掉废液。59 7.室温，12000rpm，离心2min。8.打开吸附柱的盖子，放置10min，将残余乙醇晾干。9.将吸附柱置于1.5mLRNase-free的离心管中，并将30μL的DEPC-treatedddH2O滴在吸附膜的中部，静置5min。12000rpm，离心3min，所得溶液即为RNA，然后进行后续实验或-80℃保存。6.3.5反转录为cDNARNA模板10μLRandomprimer1μLRNasefreeH2O4.2μL混合均匀，65℃使其变性5min，然后放入冰上冷却。离心再加入5×RTReactionMix4μL-HiFiHRTase/RIMix0.8μL-42℃孵育50min，85℃加热5min，使HiFiHRTase失活，合成的cDNA保存于-20℃。6.3.6实时荧光定量PCR反应采用SYBRGreenI荧光染料和0.2mL薄壁8连管，按照SYBRqPCRMix说明书在StepOne机器上进行RT-PCR反应。RT-PCR反应体系为（20μL）：模板cDNA1μL，引物（10μmol/L）上、下各0.4μL，2×SYBRGreenqPCRMix10μL，RoxReferenceDye0.4μL，补充ddH2O至20μL。RT-PCR反应程序为：94℃变性2min；94℃5s，60℃30s进行45个循环。用ddH2O代替cDNA模板作为空白对照，重复3次。6.3.7实时荧光定量PCR反应效率的确定当目标基因和参照基因的PCR扩增效率近似相等的情况下，可利用比较CT[115]值法来比较基因的相对表达量。制备一系列模板的稀释液，然后进行RT-PCR反应，获得基因各个浓度（重复三次）的CT值。用∆CT（CT,Target-CT,Actin）和模板稀释度的对数作图，若曲线斜率接近零（通常在-0.1~0.1之间），则二者的PCR扩增效率接近。60 6.3.8基因表达量的比较[115]-△△CT比较CT值的相对定量法是一种利用数学公式2来计算基因相对表达量的方法，其中：△△CT=△CT样品-△CT参照物，△CT＝CT靶基因-CT内参基因本章内容均以未感毒、取食饲料4h的甜菜夜蛾幼虫目的基因表达量作为1。6.4结果6.4.1不同寄主植物对甜菜夜蛾感染NPV后肠黏蛋白基因表达量的影响图6-1SeIM基因的扩增曲线和熔解曲线Fig.6-1TheamplificationcurveandmeltingcurveofSeIMSeIM基因的熔解曲线为单峰，表明产物唯一，无引物二聚体，扩增曲线正确。PCR产物经电泳和测序后发现均为目的片段，表明该引物具有较强的特异性，可用于荧光定量分析。61 图6-2取食不同食物的甜菜夜蛾感染NPV前后SeIM基因的表达量Fig.6-2ExpressionofSeIMinSpodopteraexiguawithNPV-infectedandnon-infectedfeedingondifferentfoods从上图可以看出，取食四种食物的甜菜夜蛾幼虫SeIM基因的表达量在未感毒时，均呈现上升趋势；感毒后，饲料组和黄豆组SeIM基因的表达量在12h后开始下降，而甘蓝和蕹菜组则在24h后开始下降。在感毒后48h，取食四种食物的幼虫SeIM基因的表达量，未感毒组显著高于感毒组。62 图6-3取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫SeIM基因的表达量Fig.6-3ExpressionofSeIMinSpodopteraexiguafeedingondifferentfoods从上图可以看出，取食四种食物4h后，蕹菜组SeIM基因的表达量显著高于饲料、黄豆、甘蓝组。取食24h和48h后，饲料组和黄豆组SeIM基因的表达量显著高于甘蓝和蕹菜组，并且取食48h后的饲料组显著高于黄豆组。图6-4取食不同食物的甜菜夜蛾感染NPV后SeIM基因的表达量Fig.6-4ExpressionofSeIMinSpodopteraexiguawithNPV-infectedfeedingondifferentfoods63 从上图可以看出，取食4种食物的甜菜夜蛾在感毒4h后，黄豆组SeIM基因的表达量显著高于其他3组。感毒12h后，饲料组和黄豆组SeIM基因的表达量显著高于甘蓝组和蕹菜组。感染病毒24h后，饲料组和黄豆组SeIM基因的表达量开始下降，显著低于同期甘蓝组和蕹菜组。6.4.2不同寄主植物对甜菜夜蛾感染NPV后几丁质酶基因表达量的影响图6-5SeCS基因的扩增曲线和熔解曲线Fig.6-5TheamplificationcurveandmeltingcurveofSeCSSeCS基因的熔解曲线为单峰，表明产物唯一，无引物二聚体，扩增曲线正确。PCR产物经电泳和测序后发现均为目的片段，表明该引物具有较强的特异性，可用于荧光定量分析。64 图6-6取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染NPV前后SeCS基因的表达量Fig.6-6ExpressionofSeCSinSpodopteraexiguawithNPV-infectedandnon-infectedfeedingondifferentfoods从上图可以看出，取食四种食物的甜菜夜蛾幼虫SeCS基因的表达量在未感毒时，4-24h均呈现上升趋势，而后开始下降；24h之前，基因表达量未感毒组高于感毒组；而48h时，感毒组显著高于同期未感毒组。65 图6-7取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫SeCS基因的表达量Fig.6-7ExpressionofSeCSinSpodopteraexiguafeedingondifferentfoods从上图可以看出，在取食四种食物4h后，各处理组SeCS基因的表达量未出现显著性差异；在12h后，饲料组和黄豆组SeCS基因的表达量显著高于甘蓝和蕹菜组；24h和48h后，蕹菜组SeCS基因的表达量显著高于饲料组、黄豆组和甘蓝组。图6-8取食不同食物的甜菜夜蛾感染NPV后SeCS基因的表达量Fig.6-8ExpressionofSeCSinSpodopteraexiguawithNPV-infectedfeedingondifferentfoods66 从图中可以看出，取食不同食物的甜菜夜蛾在感毒4h后，各处理组SeCS基因的表达量未出现显著性差异；感毒12h后，饲料组SeCS基因的表达量显著高于黄豆组、甘蓝组和蕹菜组；感毒24h和48h后，甘蓝组和蕹菜组SeCS基因的表达量显著高于饲料组和黄豆组。6.5讨论[116]肠黏蛋白是Wang等从围食膜中解离出来的一种粘蛋白，它能润滑昆虫肠道，保证昆虫取食时食物能够顺利通过。致病菌可与位于中肠围食膜上的糖基位点结合，保护中肠上皮细胞，而这些糖基位点大多位于肠黏蛋白上。取食饲料、黄豆、甘蓝和蕹菜的甜菜夜蛾幼虫感毒之后，SeIM基因的表达量均先呈上升趋势，然后再下降，可能原因是病毒刚入侵时，昆虫为抵御病毒增殖而大量表达。当病毒大量增殖以至于昆虫无法抵抗时，SeIM表达量下降。感毒12h后，饲料组和黄豆组SeIM基因的表达量开始呈下升趋势，而甘蓝组和蕹菜组则在感毒24h后呈下升趋势，说明取食饲料和黄豆的甜菜夜蛾比取食甘蓝和蕹菜的幼虫围食膜破坏程度强。感毒24h后，饲料组和黄豆组SeIM基因表达量显著低于其他2组，甘蓝组和蕹菜组SeIM的高表达能够保护幼虫中肠免受破坏，这与前面章节的研究相吻合。感毒48h后，未感毒组SeIM表达量显著高于感毒组，是因为在感毒48h后围食膜的破坏程度严重，昆虫已无法通过自身调节恢复正常状态，因此基因表达量下降。[117]中肠几丁质酶可以降解体壁，更新围食膜，同时还具有消化功能。取食四种食物的幼虫SeCS基因的表达量在未感毒时，4-24h均呈现上升趋势，而后开始下降，是因为幼虫在不同发育阶段基因的表达量有所差异，为生理性差异；感毒4-24h后，SeCS基因的表达量显著低于未感毒组，可能是病毒感染昆虫后，食物消化受到影响，因此SeCS基因的表达量降低。而感毒48h后，感毒组显著高于未感毒组，是因为感毒组基因表达量还在生理性的上升阶段，而未感毒组则在下降阶段。感毒24h，48h后，取食甘蓝和蕹菜的甜菜夜蛾幼虫SeCS的表达量显著高于取食饲料和黄豆。SeCS具有消化功能，维持幼虫生长，甘蓝组和蕹菜组基因表达量高说明幼虫取食及消化受病毒的影响较小。昆虫肠黏蛋白可用于有害昆虫防治的研究目标，可以将粘蛋白降解酶用于杀虫剂的研究，通过降解肠黏蛋白妨碍其在昆虫保护中肠的功能。几丁质为昆虫所特有的组成成分，可利用参与几丁质代谢中的特殊酶研制出新型农药。有研究报[118]道，几丁质酶在体外能够破坏围食膜。因此，可以利用几丁质酶对昆虫病毒进行改造，加强病毒对昆虫的入侵能力，增强杀虫效果。67 第七章结论与展望7.1结论寄主植物与昆虫病毒的互作是害虫生物防治的研究热点之一，但寄主植物对昆虫病毒感染宿主的影响及机理，至今了解尚少。本研究以不同食物资源（黄豆、甘蓝、蕹菜及人工饲料）、甜菜夜蛾和核型多角体病毒为研究对象，通过测定不同植物叶片中化学物质，明确了不同植物对病毒感染昆虫的影响，运用石蜡切片及电镜扫描技术，观察了取食不同食物的感毒甜菜夜蛾幼虫中肠组织和围食膜表面结构的变化；此外，利用Illumina/Solexa新一代测序技术，构建了感毒和未感毒的甜菜夜蛾中肠转录组，并对中肠功能基因的表达量进行了分析。主要结论如下：1)取食人工饲料或黄豆的甜菜夜蛾幼虫，对病毒具有较强的易感性，而取食甘蓝或蕹菜的幼虫对病毒的易感性较弱。该部分的研究结果，从生态现象解释了取食不同寄主植物的甜菜夜蛾对病毒的敏感性不同，在实践上可以指导农业生产。2)经石蜡切片和电镜扫描技术观察发现，取食黄豆或人工饲料的感毒幼虫中肠和围食膜受破坏程度最重，而蕹菜的最弱。该部分从生理层面揭示了寄主植物对病毒感染宿主的影响，即甜菜夜蛾对病毒的易感性与宿主中肠组织及围食膜受破坏的程度相关，验证了前面一章的生态学效应。3)构建了感毒48h（48hD）和未感毒（48hW）的甜菜夜蛾中肠转录组，并对中肠功能基因表达量进行差异分析，该部分内容从分子生物学上验证幼虫对病毒易感性的差异与植物种类有关。7.2展望本研究从生态学、昆虫生理生化及分子生物学角度，分别研究了寄主植物对甜菜夜蛾核型多角体病毒感染宿主的影响，研究内容尚且饱满，但还有许多地方值得深入探讨。根据近期的研究热点，对其进行了展望：1)昆虫被病毒感染后，细胞凋亡caspase基因和抗菌肽gloverin基因的表达量与围食膜结构变化的关系。2)在实际应用中，以肠黏蛋白、几丁质酶等为研究对象，研制出新型杀虫剂，通过破坏昆虫中肠来解决虫害问题。3)植物中的化学物质（几丁质酶、凝集素等）怎样与昆虫病毒发生协同作用68 破坏围食膜的结构与化学组成，及其对围食膜基因的调控？4)筛选出围食膜蛋白，利用蛋白互作的方法，探讨围食膜蛋白与病毒蛋白在昆虫体内外互作效应的差异。69 参考文献[1]徐爱仙.甜菜夜蛾核型多角体病毒防治蔬菜甜菜夜蛾田间药效试验[J].长江蔬菜,2013,(6):50–51.[2]CroninJT,BhattaraiGP,AllenWJ,etal.BiogeograpHyofaplantinvasion:plant-herbivoreinteractions[J].Ecology,2015,96(4):11151127.[3]杨凯,庞义.甜菜夜蛾核多角体病毒BAC-TO-BAC外源基因表达系统的建立[J].生物工程学报,2003,19(4):412418.[4]AsgariS.Regulatoryroleofcellularandviralmicrornasininsect-virusinteractions[J].CurrentOpinioninInsectScience,2015,8(8):104110.[5]HuangGH,GarretsonTA,ChengXH,etal.PhylogeneticpositionandreplicationkineticsofHeliothisvirescensascovirus3h(HvAV-3h)isolatedfromSpodopteraexigua[J].PlosOne,2012,7(7):e40225.[6]万年峰.植物-甜菜夜蛾-核型多角体病毒互作的化学生态学研究[D].复旦大学博士论文,2016.[7]WanNF,JiangJX,LiB.EffectofhostplantsontheinfectivityofnucleopolyhedrovirustoSpodopteraexigualarvae[J].JournalofAppliedEntomology,2016,140(8):636644.[8]MonobrullahM,ShankarU,BhartiP,etal.EffectofhostplantontheinfectivityofSlMNPVtoSpodopteralitura(Fabricius)(Lepidoptera:Noctuidae)larvae[J].JournalofAsia-PacificEntomology,2007,10(2):151155.[9]ShikanoI,EricssonJD,CoryJS,etal.Indirectplant-mediatedeffectsoninsectimmunityanddiseaseresistanceinatritrophicsystem[J].BasicandAppliedEcology,2010,11(1):1522.[10]AliMI,FeltonGW,MeadeT,etal.InfluenceofinterspecificandintraspecifichostplantvariationonthesusceptibilityofHeliothinestoabaculovirus[J].BiologicalControl,1998,12(1):4249.[11]PlymaleR,GroveMJ,Cox-FosterD,etal.Plant-mediatedalterationoftheperitrophicmatrixandbaculovirusinfectioninLepidopteranlarvae[J].JournalofInsectPhysiology,2008,54(4):737749.[12]TellamRL,EisemannC.ChitinisonlyaminorcomponentoftheperitrophicmatrixfromlarvaeofLuciliacuprina[J].InsectBiochemistryandMolecular70 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