陆地棉(Gossypium hirsutum L.)GhWRKY75的克隆及表达分析.pdf

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1、分类号：密级：学号：20162112002单位代码：10759石河子大学硕士学位论文陆地棉（GossypiumhirsutumL.）GhWRKY75的克隆及表达分析学位申请人张鹏飞指导教师张薇教授谢宗铭研究员申请学位类别专业硕士专业名称农业硕士研究领域作物所在学院农学院中国·新疆·石河子2018年6月CloningandExpressionAnalysisofGossypiumhirsutumL.GhWRKY75ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmento

2、ftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhangpeng-fei(Crop)DissertationSupervisor:Prof.ZhangweiJune,2018石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年

3、月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要目的：棉花枯萎病严重影响了棉花的产量及品质，棉花抗枯萎病相关基因的筛选及功能研究对棉花抗病育种具有重要意义。本研究从陆地棉抗病品种中克隆GhWRKY75转录因子基因，分析其表达特性

4、，构建过表达载体转化拟南芥，为进一步研究该基因的功能及培育棉花抗枯萎病品种奠定基础。方法：以枯萎病菌诱导的棉花基因表达谱中得到的差异表达WRKY基因为探针，利用电子克隆结合RT-PCR技术分离目的基因，采用生物信息学方法对基因序列进行分析，利用实时荧光定量PCR技术分析基因的表达特性，构建植物过表达载体，通过农杆菌介导的转基因技术将植物过表达载体转入拟南芥植株，筛选得到转基因拟南芥后代。结果：1、利用电子拼接及RT-PCR技术，从陆地棉抗病品种的根部cDNA中克隆得到一个新的基因，并命名为GhWRKY75（登录号：MH138002）。

5、对该基因序列进行分析显示，GhWRKY75基因全长692bp，开放阅读框513bp，含有一个内含子，编码170个氨基酸；具有1个WRKY结构域及1个典型的C2H2型锌指结构，属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族。同源基因进化树分析显示，该基因与雷蒙德氏棉亲缘关系最近，基因编码的蛋白总原子数为2715，分子量为19.51kd，分子式为C857H1344N246O260S8，理论上等电点是9.30，蛋白的不稳定性指数（II）为32.05，将该蛋白质分类为稳定蛋白，脂肪指数是60.12，属于疏水性蛋白。2、对基因启动子序列分析显示，在GhWRKY

6、75基因启动子区中含参与植物防御和应激反应的作用调控元件，参与植物对乙烯、茉莉酸、水杨酸响应的作用调控元件以及对低温响应的作用调控元件和对光响应的作用调控元件等。3、实时荧光定量PCR分析了GhWRKY75基因的表达模式，在抗病和感病品种中，GhWRKY75基因均能够被枯萎病菌和激素SA、ET、JA诱导表达。在抗病品种中，GhWRKY75基因在枯萎病菌和激素SA诱导后均呈现下调表达，在激素ET、JA诱导后均呈现上调表达；在感病品种中，GhWRKY75基因在枯萎病菌、激素SA、ET、JA诱导后均呈现上调表达。4、构建GhWRKY75基因

7、植物过表达载体35S:GhWRKY75，利用农杆菌介导的蘸花法转化拟南芥，对拟南芥转化种子进行筛选，共得到5个转基因株系，收获成熟种子进行抗性筛选，获得T2代拟南芥植株种子，为进一步研究基因功能奠定基础。结论：本研究克隆得到GhWRKY75基因，属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族；qPCR分析表明，该基因参与棉花对病原菌及激素SA、ET、JA的应答响应，推测GhWRKY75转录因子可能与棉花的抗枯萎病相关。关键词：陆地棉；基因克隆；WRKY转录因子；表达分析IAbstractObjective:Cottonfusariumwiltseri

8、ouslyaffectstheyieldandqualityofcotton.Screeningandfunctionalstudiesofgenesrelatedtotheresistancetofusariumwil