食源性致病菌金黄色葡萄球菌检测标记的发掘研究

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1、上海交通大学博士后学位论文食源性致病菌金黄色葡萄球菌检测标记的发掘研究姓名：刘战民申请学位级别：博士后专业：生物学指导教师：史贤明20070701上海交通大学博士后研究报告食源性致病菌金黄色葡萄球菌检测标记的发掘研究摘要金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaldreH学)是引起人类感染和细菌性食物中毒的一种重要致病茵，严重威胁人类生命健康，国内外学者一直致力于&aureusPCR检测技术的研究，然而，近年的研究发现，建立在早期的分子捡测基础之上的PCR检测技术出现了一些假阳性和假阴性的检测结果．早期提供的

2、检测标记其数量少、特异性不高，成为制约PCR检测技术发展的瓶颈．本研究利用已有的微生物基因组全序列信。恩资源，采用比较基因组学和生物信息学相结合的方法，发掘到saureus的新特异性检测标记，在此基础上建立了&aureusPCR检测技术．其主要内容如下：利用微生物基因组资源和比较基因组学的研究方法，采用perl编程语言编写了序列格式转化软件、基因组序列分割软件以及自动调用序列比对BLASTN的软件。通过＆aureus种内序列的比对分析，总共获得saureus种内保守的序列片段4009个，再将这些种内保守片段与其他

3、微生物基因组序列进行比对分析，剔除其中相同的序列片段，保留下来1371个种间特异性片段，即为Saureus分子检测标记．对最aureus检测标记序列进行基因注释和生物学原理的分析，筛选获得了3个&Qureu,$分子检测标记，sarA．p翱nea∞和ricK三个基因序列．通过引物设计和PCR扩增，20株细菌验证表明：sara，permease不具有金黄色葡萄球菌种的特异性；119株细茵验证表明：rick基因扩增得到预期的289bp特异性片段，显示vicK具有良好的种特异性，是saureus分子检测标记。以vicK基

4、因序列为最alll-ell8特异性检测标记，经过优化PCR反应体系的众多参数，建立了置a／／／'O／／$PCR检测方法．该反应体系为：lplTaqDNAPolymerase(2．5U／p1)，5pl10XPCRBuffer，3“lMgCI2(25tool／L)，4pldNTPMixture(各2．5mmOl／L)，llxlvicKl，1IIlvieK2，1批l模板DNA，34plddH20；PcR反应参数为：95"(3预变性5rain；94℃40s，52℃40s，72℃lmin，共35次上海交通大学博士后研究报告

5、循环；最后1次循环后72℃再延伸10min；检测灵敏度为5．5×103拷贝／pl，具有良好的稳定性。关键词：食源性；金黄色葡萄球菌；检测标记；比较基因组学n上海交通大学博士后研究报告DetectableMarkerMiningforFood—BornePathogenicStaphylococcusaureusABSTRACTStaphylococcusOltreus(&aureus)isorloofmainpathogemca．商nghumaninfectionandfoodpoisoning．Asarlinc

6、reeeir目lythreatentohealthconcern．researche．sintheworldhavedonerase可chesindevelopmentofdetectiona箦aysfor&t∞／4rez／#。However,somef爿∞positiveandnegativecasesweredescribedwithpreviousPCRassaysbecausethosema'kersusedinthemwereonlyafewonesandnotveryspecificwhichbeca

7、methebottleneckofdevelopmentofPCRa筠雕毫inthisresearch．anovelaureu争speciflcmarkerfordetectionassaywasganedthroughthecombinationof呷ativegenomicsand埙oinformaticswithmiorobialgenomicdatabase,furthermore,deveopmentofPCRassaysfordetectionaf最QUTe／,tg蛔n9thisnovelaureus

8、．spedficmarker．Thernanresultswereasfallowed：Throughthecombinationofmicrobi矗genomicdatabaseandcompar馥ivegenomics,andsomer玎velsoftwaresinperllanguageindudingformatchangea‘ldgenornicsplittin