利用Crispr_Cas9技术构建灵芝靶向基因敲除体系

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士学位论文利用Crispr/Cas9技术构建灵芝靶向基因敲除体系ConstructionofGanodermalucidumTargetingGeneKnockoutSystemUsingCrispr/Cas9Technology研究生姓名：陈建超指导教师：郭立忠教授学科专业：微生物学研究方向：微生物基因工程中国·青岛二0一八年六月ConstructionofGanodermalucidumTargetingGeneKnockoutSystemUsingCrispr/Ca

2、s9TechnologyThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceChenJianchao（CollegeofLifeScience）Supervisor:GuoLizhongQingdao.ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外

3、，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密

4、后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士学位论文摘要利用Crispr/Cas9技术构建灵芝靶向基因敲除体系摘要灵芝(Ganodermalucidum)是一种名贵的的大型药用真菌，具有极高的营养价值和药用价值，素有“神草”的美誉，在我国有着6000多年的应用历史，其主要作用是作为一味中药用来入药。但是，作为一种药用价值极高的大型担子菌，科学家们对其的研究还处于初始阶段，尤其是对灵芝的转基因方法和基因编辑体系的研究方面。现有报道的基因编辑技术大多是以同源重组原理为核心，但受

5、限于各种因素，灵芝中同源重组的比例特别低，大概107个原生质体只能得到1-2个转化子，这极大地限制了人们对灵芝功能基因组学的研究，并严重影响了其药用价值的开发。CRISPR/Cas9是近年来发现的一种存在于细菌和古菌中保守的获得性免疫防御机制，最近几年CRISPR/Cas9被开发成为了一种方便灵活高效的基因组编辑技术，能够进行精确高效的基因敲除或者修饰，已经广泛应用于原核生物和动植物如大肠杆菌、小鼠、农作物、人类等生物的基因编辑，但是在大型食药用真菌中的报道较少。在本研究中，我们以已测序的单倍体灵芝25-1

6、为试验材料，以灵芝ura3基因为靶向基因进行试验。首先构建了cas9表达载体pMD-Cas9，该载体由gpd启动子基因、cas9基因、Tpdc终止子基因、sdhB抗性基因和pMD-18T骨架组成，其中gpd启动子基因为灵芝内源基因，以灵芝25-1基因组DNA为模板克隆；cas9基因通过pORE-Cas9载体为模板克隆；Tpdc终止子基因来源于里氏木霉Qm6α基因组，以木霉基因组DNA为模板克隆；sdhB抗性基因为灵芝内源琥珀酸脱氢酶基因，通过点突变（CAC-CTC）后形成编码萎锈灵抗性的基因。通过PEG介导

7、的原生质体转化法将表达载体转入野生型灵芝25-1中，然后利用萎锈灵筛选转化子，最后通过粗蛋白提取验证了cas9基因能在灵芝体内正常表达，将得到的转化子命名为灵芝-cas9，并经过传代培养证明了cas9基因可以在灵芝25-1中稳定遗传。随后在灵芝25-1全基因组序列库中找到ura3基因完整序列，根据CRISPR设计原则设计目的基因，并与全基因组序列对比，避免出现相同序列，然后将T7启动子设计到引物中，以木霉的CRISPR体外转录gRNA质粒为模板，扩增得到含有T7启动子、20bp目的基因和sgRNA序列的gR

8、NA片段。利用体外转录试剂盒将gRNA进行体外转1青岛农业大学硕士学位论文摘要录，然后通过PEG介导的原生质体转化法将转录得到的gRNA转入灵芝-cas9中，使灵芝25-1的ura3基因产生双链断裂（DSBs）并诱导菌株发生非同源性末端修复（NHEJ），最后通过5-FOA筛选得到目标突变株，提取目标突变株的基因组通过测序的方式检测目的基因附近的碱基序列并与野生型对比。研究结果证明，灵芝单倍体25-1的ura3基因