rna干涉抑制htert对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制的研究

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1、缩略词RNAi英文全称英文缩略词表shRNAsmallhairpinRNA中文全称RNA干涉小片段干涉RNA小片段发卡样RNAhTERThumantelomerasereversetranscriptase人端粒酶逆转录酶RISC西豫口1RNA-inducingsilencingcomplexRNA诱导沉默复合物humantelomeraseRNA人端粒酶RNAtelomeraseassociatedproteinl端粒酶相关蛋白1GAPDHglyceraldehydephosphatedehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶TR

2、APtelomericrepeatamplificationprotocol端粒重复序列扩增法MOIFISHPNAmultiplicityofinfection感染复数fluorescenceinsituhybridization荧光原位杂交peptidenucleicacid核酸肽直赢匡抖盍堂簋±堂僮途童论文独创性声明本论文坐王造控剑堕!垦墼挝照厦擅麴照生篮整堕丞扭里盟至L是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和

3、所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专业：拉经生I型作者签名：血盈咯日期：论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：导师签名：j弛日期：RNA干涉抑制hTERT对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制研究第—部分：靶向hTERT小片段干涉RNA表达载体的构建和表达【目的】构建靶向hTERT的小片段鼢舱(siRNA)表达载体，为研究RN

4、A干涉(RNAi)在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础．I方法】根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框，连接入质粒载体pRNAT-H1．1／Neo，转染293T细胞，荧光定量RT-PCR和westernblot法检测转染后293T细胞中hTERT表达。【结果】重组质粒经测序鉴定证明hTERTsiRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT-H1．1／Neo质粒中，并筛选出一个抑制hTERT表达效率最高的序列，其hTERT表达仅达22．90％．【结论】成功构建并筛选出一个抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA

5、表达载体，为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础。第二部分：靶向hTERTsiRNA慢病毒表达载体的构建【目的l通过构建靶向人端粒酶催化亚基(hTERT)RNAi慢病毒载体，获得可供转染的滴度，为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。【方法】根据hTERT设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链插入到pLVTHM质粒，生成合RNAi盒的载体，然后与pCMV-dR8．74和pMD2G病毒包装所必须的元件经脂质体导入T293细胞，包装成慢病毒，收集上清浓缩病毒并检测其滴度．RT-PCR检测干扰后细胞内hTE

6、RT表达变化．【结果】将目的序列成功连接到载体上，并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒。RT-PCR和TRAP检测结果证实构建的hTERT-siRNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达和端粒酶活性。【结论】成功构建了携带靶向hTERT基因的RNAi慢病毒载体。该载体能够有效抑制hTERT的表达和端粒酶活性，为以hTERT为靶点的胺质瘤基因治疗的后续研究奠定基础。第三部分：慢病毒介导的RNAi技术抑制hTERT表达对U87胶质瘤细胞的作用研究【目的】观测利用RNAi技术下调hTERT表达对U87人脑胶质瘤细

7、胞的影响。【方法】将慢病毒为载体的靶向hTERTsiRNA构建体—Lt-I感染U87细胞，舍无效序列的慢病毒Lt-non作为空载对照，正常培养U87细胞作为阴性对照．RT-PCR检测hTERT表达，TRAP法检测端粒酶表达，MTT和流式细胞检测分析细胞增殖并口周期变化，荧光原位杂交检测端粒长度变化，TransweU法分析细胞侵袭力，观测裸鼠皮下瘤生长．【结果】Lt-I可以明显下调hTERT的表达，端粒酶活性，细胞侵袭力和裸鼠皮下瘤生长。【结论】靶向hTERT的RNAi基因治疗能够抑制hTERT表达、端粒酶活性和细胞侵袭力，这些效应先

8、于肿瘤细胞的端粒长度明显缩短前出现，表明hTERT在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，可作为胶质瘤基因治疗的优选靶基因．I关键词】hlmRT；RNA干涉；DNA表达载体；慢病毒属；基因治疗作者：赵鹏导师：傅震教授Studyontheeff