microrna-107在胶质瘤和胶质瘤干细胞中的生物学功能研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文microRNA一107在胶质瘤和胶质瘤干细胞中的生物学功能研究ThebiologicalfunctionofmicroRNA一107ingliomaandgliomastemcells课题来源：国家自然基金(No．81171179，81272439)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院陈垒姜晓丹外科学学术型博士研究生珠江医院2013年05月10日广州博士学位论文MicroRNA．107在胶质瘤和胶质瘤干细胞中的生物学功能研究博士研究生：陈垒指导教师：姜晓丹教授摘要胶质瘤是颅内最常见，恶性程度最高的肿瘤。具有侵袭性生长，易复发，肿瘤组织

2、内部细胞异型性的特点。目前的治疗包括手术，放化疗对提高胶质瘤的生存期并没有取得显著性效果。在过去的十年间，胶质瘤的中位生存期依然维持在12个月甚至更少。大量的证据表明除了胶质瘤细胞自身较强的增殖能力和侵袭性，在胶质瘤组织中还存在一群细胞，表现出和神经干细胞相似的特性，即具有无限增殖，自我更新，多系分化的特点，被命名为胶质瘤干细胞。一些研究者认为胶质瘤干细胞具有放化疗抵抗性，是胶质瘤发生以及复发的根源。基于以上观点，寻找新的药物或者分子靶向治疗胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞就显得尤为重要。MicroRNAs是一种内源性的非编码RNA分子，通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)的碱基序

3、列完全或部分互补结合清除靶mRNA或者抑制蛋白的合成而发挥其生物学功能。MicroRNAs在转录后水平调节靶基因的表达主要依赖于MicroRNAs与靶基因的互补程度。在植物中，MicroRNAs与靶基因近似结合，导致靶mRNA被切割或者降解。在动物中，MicroRNAs与靶基因完全结合导致了靶蛋白的抑制。生物信息学分析表明人体中至少三分之一的基因被小RNA调控。这些MicroRNAs既可能充当癌基因又有可能充当抑癌基因的作用。近年来发现，大量的MicroRNAs参与了胶质瘤的发病过程。一些microRNAs在胶质瘤增殖，侵袭中发挥了重要作用，比如Let．7，miR．146b等。一些摘

4、要microRNAs在胶质瘤干细胞中增殖，分化，凋亡中发挥着重要作用，例如miR．124，miR-137，miR一451，miR一34a和miR．125b。MiR一107定位于10号染色体10q23．31。先前有研究表明，miR．107在多种肿瘤中异常表达。参与了前列腺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺癌的发生和发展。然而，有关miR一107在胶质瘤和胶质瘤干细胞中的生物学特性目前并没有得到系统性研究报道。本实验拟探讨miR一107在胶质瘤以及胶质瘤干细胞中的表达情况，研究其对胶质瘤和胶质瘤干细胞增殖，侵袭等生物学特性的影响，并进一步探讨其内在作用机制，为靶向治疗胶质瘤提

5、供新思路。第一部分p53诱导的microRNA．107抑制胶质瘤细胞增殖、下调CDK6和Notch一2的表达目的：研究miR一107在胶质瘤组织及细胞中的表达情况，同时过表达或者抑制miR-107观察其对胶质瘤细胞增殖，细胞周期等影响。探讨p53对胶质瘤细胞miR．107表达的影响，研究miR一107对胶质瘤细胞增殖影响的具体机制。方法：1实时定量RT-PCR检测miR一107在胶质瘤组织(3例WHOII级、4例WHOIII级、7例WHOⅣ级)及细胞系(U87，U251和A172)中的表达。2P53质粒的构建和转染。首先扩增p53DNA(上游序列为GCCGGATCCACCATGatg

6、gaggagccgcagtcaga，下游序列为GCCGAATTCtcatcagtctgagtcaggccctt)然后将p53DNA克隆进入pcDNA3．1(+)载体。转染的过程如下：lX105个细胞放置在6孔板的每一个-TL咩'，并孵育24小时。根据说明书的指示，用Lipofectamine2000转染细胞，6小时后培养基被完全培养基替代。48小时后应用RT-PCR技术分别检测miR．107在U87，U25l和ll博士学位论文A172胶质瘤细胞系中的表达。3慢病毒的构建和转染。首先合成miR．107前体产物，接着用限制性内切酶EcoRl和BamHl切割miR．107前体产物以及pSI

7、N．EF2．IRES．GFP．puro慢病毒载体。pSIN-EF2一miR一107．IRES—GFP-puro慢病毒载体合成后，将HEK293包装细胞放置在平板中并转染载体质粒和包装质粒(慢病毒转移质粒(20ug)，psPAX2(15ug)，pMD2．G(5ug))。72小时候收割上清液，慢病毒的最终浓度为每毫升7．8×lO7TU。使用Polybrene将慢病毒载体转染到U87和A172细胞。通过抗体分选，大约一周后得到稳定的克隆。实验中所用细胞都分成3组