团头鲂缺氧应答相关基因分子调控机制的研究

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1、上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，

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3、学硕士学位论文团头鲂缺氧应答相关基因的分子调控机制的研究摘要团头鲂（Megalobramaamblycephala）属不耐低氧的鲤科鱼类。在大规模经济养殖中极易缺氧，成为限制其产量的主因素。在动物耐受低氧的生理应答的分子机制中，一系列氧敏感基因的转录、调控诸如物质和能量代谢、血管生成以及细胞增殖和凋亡等生理过程，从而维持机体在缺氧状态下的存活。目前脊椎动物中已发现IGFBP-1（胰岛素样生长因子结合蛋白1）和EPO（促红细胞生成素）对低氧环境非常敏感；在经济鱼类中，它们分子水平上的研究非常有限，例

4、如结构、表达特征的调控机制。通过克隆团头鲂IGFBP-1及EPOcDNA全长，分析其结构、功能及其调控因素，对解释团头鲂不耐低氧的分子机制和耐低氧团头鲂良种的选育有着重要的研究意义。本研究一方面通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了团头鲂IGFBP-1和EPO的cDNA全长序列，分别为1135bp和903bp，其ORF开放阅读框分别为789bp和552bp，可编码262和183个氨基酸残基。通过信息学软件分析表明，团头鲂IGFBP-1的N端（含典型IGFBP蛋白家族基序）及C端（含一个甲状腺球蛋

5、白结合位点）结构域具有较高的保守性。团头鲂EPO蛋白分子中有三个N-连接和一个O-连接糖基化位点；N端含有与EPO分子成熟相关的信号前肽。通过半定量RT-PCR检测，分析了团头鲂胚胎和成鱼各组织中IGFBP-1及EPOmRNA的时空表达。在常氧状态下，团头鲂IGFBP-1表达量随着胚胎发育过程逐渐增加；EPO在整个胚胎发育时期表达量均较为恒定，无明显差异，进一步经整胚原位杂交探针检测结果与RT-PCR结果相一致，空间上EPOmRNA主要在胚胎的前、中、后脑表达。在团头鲂成鱼不同组织中，所有被检测组

6、织中IGFBP-1均有mRNA表达，其中以肝脏、肠和心脏中表达水平较高。而EPOmRNA在除肝、脑和心脏以外的其他组织中均未检测到。缺氧（溶氧值约1.0mg/l）4h后，IGFBP-1mRNA水平在皮肤、肝脏、肾脏、脾脏、肠、和心脏中分别为对照组的23.3、21.0、32.7、26.1、19.0和32.0倍；恢复水中溶氧24h后，各个组织中IGFBP-1转录水平均恢复到正常组水平。缺氧（溶氧值约1.0mg/l）4h后，EPO在脑、肝和心脏中的转录水平有显著变化，分别为对照组的19.8、20.1和3

7、9.4倍；并且肾脏组织中出现微量表达。平行实验组恢复水中溶氧24h后，EPO表达量在所检测的组织中均降至正常组水平；肾脏组织中几乎检测不到EPOmRNA。研究结果推测团头鲂II上海海洋大学硕士学位论文IGFBP-1和EPO在团头鲂缺氧应答过程中发挥了重要的作用。本研究为探索团头鲂在缺氧环境中分子水平的调控机制提供了一定的实验依据。在硕士论文研究阶段，还对金鱼不同品系Tgf2转座子的侧翼序列及拷贝数进行了扩增及鉴定，建立一种可检测Tgf2转座子在金鱼基因组插入拷贝数和侧翼序列的接头反向新方法。在金鱼

8、（Carassiusauratus）的珍珠品系中寻找具有天然有活性的Tgf2转座子的个体，获得了珍珠Tgf2转座子两端的侧翼DNA序列；发现在左臂末端和右臂末端有相同的8bp重复碱基序列。在珍珠、琉金和蝶尾品系中分别发现6、4和4种末端8bp重复碱基序列，并对侧翼序列进行了鉴定，结果显示金鱼Tgf2转座子至少存在6种拷贝，且不同品系中侧翼及拷贝数目不一。与昆虫piggyBac转座子倾向插入TTAA和Tc1/mariner转座子家族偏好AT位点相比，鲤科Tgf2转座子为随机插入，这为