淡水甲壳类动物新型病原——中华绒螯蟹螺原体菌体蛋白模拟表位的研究及快速检测方法的建立

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1、隶劫大·粤博士学位论文淡水甲壳类动物新型病原．中华绒螯蟹螺原体菌体蛋白模拟表位的研究及快速检测方法的建立Discoveryofthemimicepitopeofanovelspiroplasmapathogeninfreshwatercrustaceans删2㈥511㈣687-Spiroplasmaeriocheiris—andestablishmentofarapiddetectionmethodforitADissertationSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofDoctorofM

2、edicineBYZhangYingSuErvisedbySupervisedZhangJianqiongMedicalSchoolSoutheastUniversityJuly2013东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：丛堕日期：幽．p东南大学

3、学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布论文的全部或部分内容。论文的公布授权东南大学研究生院办理。研究生签名：燧导师签名：中文摘要虾蟹是我国重要的经济水生甲壳动物，也是出口创汇的重要水产养殖品种。伴随着水产养殖业快速发展的同时，病害造成的经济损失也越来越大，其中颤抖病是中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)最严重的流行病之一。2002年王

4、文等首次在水生动物体内发现致病性螺原体，2004年根据“科霍法则”确定其为中华绒螯蟹颤抖病的病原体，随后又发现该螺原体还可导致南美白对虾(PenaeusvannameO、克氏原螯虾(Procambarusclarkia)的大规模死亡，2010年正式将其命名为中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasmaeriocheiris)。对于这一新型病原微生物的生物学特性、致病机制、防治方法等诸多方面急需深入系统研究。本论文应用免疫学技术、分子生物学技术、噬菌体展示肽库筛选技术等针对中华绒螯蟹螺原体开展研究，并获得以下主要结果：1、抗中华绒螯蟹螺原体系列单抗及多抗的制备

5、及鉴定分别用中华绒螯蟹螺原体(＆eriocheiris)菌悬液及全菌体蛋白免疫Balb／c小鼠，按常规方法融合，得到20株稳定分泌抗＆eriocheiris抗体的杂交瘤细胞株，从中挑选4株连同本实验室前期制备的2株杂交瘤细胞，制备、纯化单克隆抗体，并进行免疫球蛋白类型、亲和力、滴度以及特异性的鉴定。结果发现，单抗5C11、5D9、6F5、12H5重链均为IgGl，轻链均为K，单抗6H7、7C8重链为IgG2a，轻链为K；6H7亲和力最高，5D9最低；ELISA，Westernblot检测表明，7C8和6H7为Seriocheiris特异性单抗，其余4株单

6、抗与＆eriocheiris发生结合，同时与S．mirum、S．mellife删聊出现交叉反应；6株单抗均与江苏省八个不同地区分离的＆eriocheiris菌株结合。多克隆抗体与＆eriocheiris结合，同时与S．mirum、S．melliferum以及解尿脲原体(Uurealyticum)出现交叉反应。2、中华绒螯蟹螺原体特定功能蛋白模拟表位的筛选及鉴定通过制动、变形等试验发现，单抗6F5、7C8、12H5使&eriocheiris形态发生明显改变，多数螺旋结构消失，光镜下呈散点状；单抗5D9及混合单抗使&eriocheiris运动性部分丧失，光镜

7、下见其运动较呆板，在液面呈漂浮状。在此基础上，首先以S．eriocheiris特异性单抗6H7为靶分子筛选噬菌体展示十二肽库，东南大学博士学位论文获得一致性插入序列：FQGINHYNQMER，通过生物信息学分析，发现该序列与S．eriocheiris的类粘附蛋白(ALP)具有一定的同源性；Westernblot结果表明单抗6H7能够与ALP结合；ELISA结果显示，展示该序列的噬菌体肽能够与6H7特异性结合，并且呈现剂量依赖性，Seriocheiris能够竞争抑制这种结合；免疫电镜发现单克隆抗体6H7能够与S．eriocheiris菌体表面结合。随后采用

8、相同的筛选策略，以能够使S．eriocheiris发生形态改变的6F5，7C8，