糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌bkca通道的变化

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1、中图分类号：R89；R36；R39硕士学位论文糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌BKCa通道的变化院（系）、所基础医学院研究生姓名学科、专业人体解剖与组织胚胎学导师姓名二Ο一三年三月目录1糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌BKCa通道的研究……………11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………31.3前言……………………………………………………………51.4材料与方法……………………………………………………71.5结果………………………………………

2、……………………121.6讨论……………………………………………………………241.7结论……………………………………………………………301.8参考文献………………………………………………………311.9英汉缩略词对照表……………………………………………352致谢……………………………………………………………363胃平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa）的研究（综述）…………………………………………………………………39糖尿病胃轻瘫大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道的研究摘要目的：研究链脲佐菌素（stre

3、ptozotocin，STZ）诱导的糖尿病胃轻瘫大鼠(disbeticgastroparesis，DGP)胃平滑肌细胞大电导钙激活钾通道（largeconductancecalcium-activatedpotassiumchannels,BKCa）的变化，探讨糖尿病胃轻瘫的病理机制与胃平滑肌细胞BKCa通道的关系，为探索新的药物和治疗方法提供实验依据。方法：1.动物分组及造模：健康纯系雄性SD大鼠50只，随机分为对照组和模型组。模型组用0.1mmol/L柠檬酸缓冲液配制的2%STZ60mg/Kg一

4、次性腹腔内注射，3日后禁食不禁水6h，采尾血测空腹血糖，以血糖持续一周≥16.9mmol/L为糖尿病造模成功；对照组用0.1mmol/L柠檬酸缓冲液2ml/Kg一次性腹腔内注射，两组均给予标准鼠饲料继续喂养。10周后测量大鼠空腹血糖及体重，将1mg/ml美蓝溶液0.4ml灌胃，30min后处死大鼠，将胃内残留物用4ml生理盐水冲洗并收集冲洗液，离心取上清液，用722分光光度计在640nm波长检测吸光度值（OD），测量胃内色素残留率。血糖≥16.9mmol/L伴胃排空速率显著下降表明DGP造模成功。2

5、.急性酶分离SD大鼠胃平滑肌细胞：将大鼠禁食不禁水24h后处死，开腹取胃，剪开胃部,用无钙生理溶液漂洗干净，体式显微镜下剥下肌层,沿肌条方向剪成1mm×3mm的组织条块，置于低钙生理溶液中保存20分钟后放入木瓜蛋白酶酶液，于37℃恒温水浴箱中振荡消化15min，在显微镜下找到10个左右细胞/低倍视野(10×10)，且细胞膜完整光滑，折光性好，即可终止酶解，置于4℃冰箱中保存备用。3.单通道膜片钳技术记录大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道电流：选择贴壁良好、胞膜完整和折光性好的细胞进行实验。操纵微推进器使电

6、极尖端贴附在细胞表面，采用细胞贴附式膜片(cell-attachedpatch)和内面向外式膜片(inside-outpatch)记录BKCa电流。采样频率为10kHz，方式为GapFree，时间为30秒。记录数据由pClamp6.0软件储存，用Clampfit10.1软件分析，Origin8.0软件进行直线拟合与绘图。4.免疫组织化学技术测定BKCa通道蛋白KCNMA和KCNMB1的表达：将胃组织固定、脱水、透明、包埋，用Leica2245切片机进行切片。按抗体说明书操作步骤进行免疫组织化学检测。

7、采用OLYMPUS1X71光学照相系统拍照，Image-Pro-Plus6.0软件进行图形数据分析。结果：1.模型组大鼠体重(190±23.71g)明显低于对照组(428±25.05g),P＜0.01。模型组大鼠平均血糖浓度(30.26±2.19mmol／L)显著高于对照组(4.83±1.09mmol／L)，P＜0.01。胃内色素残留率反映了胃排空情况，模型组大鼠胃内色素残留率（54.50%±3.92%）明显高于对照组（40.69%±3.55%），P＜0.01。以上结果提示大鼠DGP造模成功2.急性

8、酶分离的SD大鼠胃平滑肌细胞多呈梭形，细胞核规则，细胞膜完整,折光性强，数量多，能满足膜片钳实验需要。3.SD大鼠胃平滑肌细胞BKCa通道单通道电流鉴定及特性：①在内面向外式膜片下，膜电位（Vm）为+30mV,于浴液中加入200nmol/LBKCa通道特异性阻断剂IbTX，膜片单通道电流被阻断。②膜片单通道电流电导值为211.7±13.6pS，具有大电导的特性。③膜片单通道电流图形具有明显的电压依赖性和细胞胞浆面钙离子浓度2+-7-7-6依赖性，浴液中游离Ca浓度分别