腺相关病毒耳蜗局部基因转染

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1、上海交通大学博士学位论文腺相关病毒耳蜗局部基因转染研究生：夏力指导教师：殷善开教授指导小组成员：冯艳梅副教授苏开明副教授专业：耳鼻咽喉科学申请学位：博士基金项目：科技部973预研项目(2009∞526504)国家杰出青年基金(30925035)研究方向：耳聋的基因治疗学号：0097259317上海交通大学2013年5月上海交通大学博士学位论文Localgenetransfectionincochleaviaadeno．．associatedviralvectorPh．Dcandidate：LiXiaSupervisor：Prof．ShankaiYinMemb

2、ersofsupervisorgroup：YanmeiFeng，associateprofessorMajor：OtorhinolaryngologyApplyfordegree：Ph．D⋯‘^‘一KaimingSu．associateprofessorFunds：theStateKeyDevelopmentProgramforBasicResearchofChina(GrantNo．2011CB504503)，ChinaNationalFundsforDistinguishedYoungScientists(GrantNo．30925035')Resear

3、chfield：GenetherapyforsensorineuralhearinglossStudentID：0097259317ShanghaiJiaotongUniversityMay2013上海交通大学上海交通大学博士学位论文学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：为，5'年捐

4、Co日上海交通大学博士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密阢(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：—磊指导教师签名：日期：如l；年j月，l夕日日期：v∥年J-月如日上海交通大学博士学位论文腺相关病毒耳蜗局部基因转染中文摘要第一部

5、分不同径路重组腺相关病毒在耳蜗细胞中的转染效率目的：使用重组腺相关病毒作为基因转染载体，分别通过耳蜗鼓阶切开途径、胶原酶处理后经圆窗膜径路、耳蜗中阶切开途径将病毒投放到内耳，比较不同径路的可靠性及安全性，为内耳功能性基因转染提供现实依据。方法：选取经闭合声场听性脑干反应测试正常的Dunkin—Hartley豚鼠18只。按照不同的耳蜗给药途径分为三组：耳蜗鼓阶切开途径(A组)、胶原酶处理后经圆窗膜径路组(B组)、耳蜗中阶切开途径(C组)。每组6只动物，随机选择单侧耳注射携带绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒(AAV-GFP，滴度3E“12PFU／mL)，对侧耳采

6、用相同的方法注射生理盐水。术后两周测试双耳听性脑干反应，处死动物，并取出双侧耳蜗基底膜。采用免疫荧光技术进行染色，计算手术侧毛细胞转染效率及毛细胞损失情况，并观察对侧毛细胞是否存在损伤及转染情况。结果：A组及B组的豚鼠术后两周闭合声场听性脑干反应显示左右耳阈值与术前无明显差别。转染表达产物的荧光信号主要分布在内毛细胞，A组豚鼠在内毛细胞转染效率是34％，外毛细胞3．6％；B组豚鼠内毛细胞转染效率为26％，外毛细胞1．2％；A组豚鼠内毛细胞的转染效率略高于B组。C组豚鼠，术后闭合声场听性脑干反应出现较明显阈移，以4kHz最为明显，内毛细胞转染效率25％，外毛细

7、胞转染效率3．7％。可见外毛细胞损伤，且以第二回最为明显。三组动物均未见对侧耳蜗毛细胞损伤及转染。结论：经耳蜗鼓阶切开途径、胶原酶处理后经圆窗膜径路、耳蜗中阶切开途径均可将病毒注射到内耳，并成功转染毛细胞。但是，在内外毛细胞中的转染效率偏低。耳蜗中阶切开途径可造成听功能的损伤及毛细胞的损失，因此，在耳蜗局部基因转染中的作用有限。关键词：转染；毛细胞；腺相关病毒；途径；听性脑干反应上海交通大学博士学位论文第二部分重组腺相关病毒滴度对转染效率的影响目的：比较不同滴度的表面酪氨酸残基敲除的重组腺相关病毒载体在耳蜗毛细胞中的转染效率。方法：选取经闭合声场听性脑干反应

8、测试正常的Dunkin—Hartley豚鼠24只，按