黄萎病菌诱导下海岛棉cdna文库构建和抗病相关基因克隆

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：郡书凌签字日期：加f3年岁月沼日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解塑j垒壅些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门(机构)送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查(借)阅。本人授权塑j堡壅些太堂可以

2、将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)学位论文作者签名：獬砍签字日期：如哆年岁月讶Et学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：翩龆弘弛签字日期：2,0B年f月zgEl电话：邮编：摘要黄萎病(Verticilliumwilt)是影响世界棉花生产的主要病害之一。育种实践证明，培育抗病品种是控制棉花黄萎病的经济有效途径。研究证明海岛棉Pima90．53对黄萎病具有高度抗性；对其抗黄萎病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明品种抗病机制，而且对棉花抗黄萎病的分子育种具有

3、重要价值。本研究以海岛棉PimagO．53为材料，构建其在黄萎病菌诱导下的根系eDNA文库，并依据文库克隆棉花抗黄萎病相关基因。主要结果如下：1．构建了黄萎病菌诱导下的海岛棉Pima90．53根系的全长eDNA文库采用SMART技术成功构建了黄萎病菌诱导下的Pima90．53根系全长eDNA文库，该文库基础库容量为1．28×106PFU，重组率94％，扩增后文库滴度大于1010PFU．mL～，插入片段平均长度1．1kb。经随机测序共获得45条eDNA序列，利用Blastx程序进行同源分析，4个eontigs与假定抗病相关基因同源性较高；3个contigs没有注

4、释，可能为新基因。2．利用文库筛选和RACE技术相结合，克隆了一个新的GbWRKYl基因利用构建的cDNA文库，结合RACE技术，获得了一个新WRKY基因(GbWRKYl)(GenBankNo．JF831361)。GbWRKYl基因eDNA全长1971bp，包括5’端非编码区271bp，3’端非编码区230bp，含有1个可能的polyA加尾信号：AATAAT；基因开放阅读框为1470bp，编码一个由489个氨基酸构成的多肽。生物信息学分析发现GbWRKYl包括2高度保守的WRKY基本结构域和锌指结构，属于WRKY家族第1类，与VvWRKY2、AtWRKY4和A

5、tWRKY3蛋白的同源性分别为62％、61％和59％；GbWRKYl属可溶性蛋白，无信号肽和跨膜结构域，包含N．糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N端肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、依赖cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位点等。G6脱隧W基因含有3个内含子，具有有保守的GT．AG剪切位点，分别为599bp、81bp、325bp。克隆得到GbWRKYl的1762bp启动子，包含植物病原诱导性启动子调控元件(RAVlAAT、Box．W1、ARE、W．box、CGTCA．motif,ERE、TGACG．motif)与非生物胁迫应答元件(HSE、TC—rich

6、repeats、WRKY71OS、WBOXNTERF3、MYCATERD1)。构建了基因融合表达载体pCamE．GbWRKYl．GFP，基因枪转化洋葱内表皮细胞，结果显示转化pCamE—GbWRKYl．GFP表皮细胞的细胞核出现绿色荧光，GbWRKYl蛋白定位于细胞核。3．Northern杂交分析了GbWRKYl在黄萎病菌接种后的表达模式，揭示了基因与棉花抗黄萎病的联系；实时定量PCR分析了GbWRKYl在不同激素处理下的表达模式，为解析基因作用机制提供了依据；构建了GbWRKYl超表达与RNAi载体，获得了转基因T3拟南芥Northern杂交分析GbWRKY

7、l表达模式发现，基因在Pima90．53的根、茎和叶组织均有表达；在受黄萎病菌、SA、MeJA和ACC的诱导后呈现不同的表达模式。在黄萎病菌诱导后，GbWRKYl基因在接种后出现持续高表达，在8h出现表达高峰，并持续高表达至接菌后12h。SA诱导后，其表达量在12h降到最低，24h基本恢复正常水平；MeJA诱导后，GbWRKYl表达量上升，在12h达到高峰，24h出现下降；ACC诱导12h，GbWRKYl表达呈现明显上升，并持续到24h。构建了GbWRKYl基因超表达和反义载体pCamE．GbWRKYl、pCamE—iGbWRKYl，通过农杆菌介导法转化拟南芥

8、，经潮霉素筛选和PCR检测，获得了Gb