人抗菌多肽分离纯化、鉴定、cdna克隆、基因重组及其结构和功能的研究

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1、摘要人抗菌多肽的分离纯化、鉴定cDNA克隆、基因重组及其结构与功能研究(攘要)研究生：杨华蓉导师：玉伯瑶教授细菌对传统抗生索的耐药问题成为临床医学中急需解决的难题，开发蔟的抗萤药物已经成为追奁眉睫熬熏要任务。人淋巴因子激淫的杀伤细胞(LAK)中存在多种具有杀菌作用的活性物质，已经在LAK细胞中发现了穿孔素、颗粒酶、颗粒溶素、LL．37、a．防御素等抗菌分子。LAK细胞中愚否还有薮它内源性抗菌敝淹不清楚。子宫颈粘滚具强大抗缨蓥穿透能力，溶菌酶的含量不足以行使其强大抗菌效力。可能存在其宦抗菌分子。我们将rIL．2、PHA刺激培养一周的人外周血单个核淋巴细胞(人LAK缨施)展5％的乙酸电动匀浆。

2、制各酸溶往鞭提耪。AU．PAGE电泳及电泳凝胶琼脂耱弥散法检测出入LAK细胞酸溶性粗提物中含有三组杀菌多肽成分，分别命名为HLP-1、HLP．2、HLP．3三个组分利用翩备性AU．PAGE电泳投术初步分离获褥这三个维分。稃将这三个组分甭反向高效液楣色谱技术进一步分离纯优，收集洗脱液、冻干获得过柱后器组分。璩月基糖弥散法筛选经RP．HPLC纯化的嚣组分的抗菌活性，较强抗菌活性的组分进行Tricine-SDS．PAGE电泳扔步测摘要定其分子量及纯度。选择纯度大于95％的蛋白组分HLP一3P21进行电泳并电转移至PVDF膜上，采取Edman降解法测定其氮端氨基酸序列。结果我们得到HLP一3P21

3、的N．端10个氨基酸的序列为脯氨酸(Pro，P)，赖氨酸(Lys，K)，精氨酸(Arg，R)，赖氨酸(Lys，K)，丙氨酸(Ala，A)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly,G)，天冬氨酸(Asp，D)丙氨酸(Ala，A)，赖氨酸(Lys，K)。将该段氨基酸序列登录美国国立医学图书馆(NcBI)，应用Blast检索工具进行短序列匹配的人蛋白质数据库检索发现：与该序列100％同源的蛋白质共有9个，其中一个为已知人非组蛋白HMG一17，四个为HMG．17的类似物，另四个为由人mRNA序列推导的理论蛋白。为鉴定抗菌活性组分HLP．3P21究竟为何种蛋白，我们以氨基酸序列PKRKAEGDAK对应

4、的碱基序列CCCAAGAGAAAGGCTGAAGGGGATGCTAAG为模板设计5’端特异引物AGAAAGGCTGAAGGGGATGC进行3，race—PCR扩增出其3’端序列，结果得到了1100bp、750bp、500bp三个不同大小的片段。分别连接至T载体转化感受态细胞后．挑选阳性菌落进行核酸测序，再将相应序列登录NCBI的人mRNA数据库分别检索出1100bp、750bp、500bp片段所对应的基因序列及其所编码的蛋白质氨基酸序列，并将结果与我们所得到的HLP．3P21的N．端氨基酸序列及碱基序列进行比较，结果发现仅l100bp及其对应的N．端氨基酸序列与HLP一3P21完全匹配。5

5、00bp及750bp的片段均为非特异性扩增，2摘要不熊匹配，掰鞋我筑能够礁定1100bp对应豹基因璇是编妫HLP-3P21的耀因，而这段基因所编粥的蛋白质就是HMG．17，基于上述生物信息学的分析鉴定出我们分离纯化的抗菌活性分子就是HMG．17。姨入窝颈藉滚羧溶性键取物审按上述方法芬分离缝亿窭了一个抗麓分子HcP，在理弛特性及抗黧活性上与翦者均奇很大戆相似性：分子量相避、HPLC出峰时间相同、均只对革兰氏阴性菌谢抗菌活性。但因获得的鬟很少，未能获得N一端氨基酸序列资料。将HMG·17避学蛋白震亲巯承毪、岱t跨貘螺旋结擒熬分据，我劐其疏水区及G【-跨膜螺旋结构主要位子17—47氨基酸残基区域

6、，而这一段结构域同时也是HMG一17分子的DNA结合区，并且在各种物种中具有高度保守性。因为0c-黔膜螺旋结构在摅菌胶分子的杀菌效应中有重簧缍矮，掰戳我{}j分裂麴建了HMG．17及HMG-17取。跨貘螺藤缕橡域(下面简称HMG-17Ⅱ)的原核表达质粒PGEX．1T．HMGl7及PGEX一1T．HMGl7d，转化大肠杆菌，进行融合表达。融含表达的蛋自聪经亲释蘑桥纯亿后，踊凝盘酶酶切，褥经Au。PAGE电泳分离分别褥到缝他豹HMG一17秘HMG-17珏。选髑大肠抟莲氨苄鬻霉素瓣药株ML-35p及绿脓杆菌标准株ATCC65922，测定HMG．17和HMG-17a的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀

7、菌浓度(MBC)，比较二者的抗菌活往，缭莱{正实HMG-178是HMG一17抗菌活後髓重要动能区。关键调：入LAK细胞抗菌欺HMG-17结构与功能jAbstractTheAntimierobialActivityofHumanHighMobilityGroupProtein17IsolatedfromHumanLAKCellsHumanlymphokine—activatedkillercelts(LAK)havebee