胶孢炭疽菌杀菌剂抗药性的机制、检测技术及治理研究

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1、＇ＩＩ．－＾－＇：Ｊ．＞ｉ燃、纖密级公巧ＵＰＣ６３２＇測■全曰制硕±专业学位研究生学位浪文Ｉ＇ｉ５ｉ、检疆城治理抑究臟脯菌杀ｉ剂抗药牲的誦作者姓名；林婷指导教师；张传淸教授专业学位名称：农、Ｉｋ推广硕＋领域名稼：秘物保担研究方向：杀幽剂抗药性展植物病害治班所在学院：农业与食品科学学院祕义摇巧自巧２０１５年１２月２１日：浙泣农林大学２０１５年１２月ZhejiangA&FUniversityDissertatio

2、nfortheDegreeofMasterMechanisms,detectiontechniques,andmanagementoffungicideresistanceinColletotrichumgloeosporioidescomplexisolatesfromstrawberryandgrapeCandidate:LINTingAdviser:ZHANGChuan-qing,ProfessorSpeciality:PlantProtectionDateofSubmission:Dec21,2015Zhe

3、jiangA&FUniversityLin’an,Zhejiangprovince,P.R.ChinaDec,2015独创性声明本人声明，所呈交的学位论文，在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位论文作者

4、亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。□不保密,本学位论文属于不保密。R（请在方框内打“√”）学位论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：摘要摘要主要由胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）引起的炭疽病是草莓和葡萄生产中发病广、防治难度大的病害之一。目前主要采用苯并咪唑

5、类、甲氧基丙烯酸酯（QoIs）类和甾醇脱甲基抑制剂类（DMIs）杀菌剂进行防治。上述杀菌剂具有高度的选择专化性，作用位点单一，在连续高剂量药剂的选择压下，使田间胶孢炭疽菌的抗药性问题日益严重并普遍。本文采用区分剂量法检测了浙江省不同地区68个草莓炭疽病菌株对甲基硫菌灵的抗药性，并对不同表现型的胶孢炭疽菌（BenS、BenR1和BenR2）进行了生物学性状和温度影响试验研究，对靶标基因β-tubulin进行了分析比较。结果显示草莓炭疽病菌对甲基硫菌灵的抗药性频率高达98.53%，且均为高水平抗药性菌株（BenR1）。

6、不同表现型菌株间在不同温度下无显著的敏感性变化，生物学性状也无显著性差异。BenR1和BenR2（甲基硫菌灵-乙霉威双重抗药性）的分子机制研究分别为β-tubulin基因198位突变（E198A）和200位突变（F200Y）。采用菌丝生长速率法测定了草莓炭疽病菌对吡唑醚菌酯的敏感性，并分析了旁路氧化与胶孢炭疽菌对QoIs类杀菌剂敏感性的关系。结果表明：无SHAM时EC50Q的平均值为6.65μg/mL；当有50μg/mL的SHAM存在时，其EC50(Q+S)的平均值为10.58μg/mL。旁路氧化的相对贡献值F平均

7、为0.96，其中78.46%的菌株的F值﹤1。进一步采用实时荧光定量PCR技术，分析了不同敏感性的草莓和葡萄胶孢炭疽菌在吡唑醚菌酯处理下其AOX基因表达的时间动态。结果显示：吡唑醚菌酯处理能诱导AOX基因的表达，在处理后6～12h内，各菌株AOX基因的表达水平均显著增强，但表达量的差异与菌株对吡唑醚菌酯的敏感性间无显著的相关性。同时对cytb基因进行了分析，葡萄炭疽病菌中cytb基因第143位未发生突变，而在草莓炭疽病菌中除检测到一株野生型菌株外，其它菌株第143位都发生了突变。建立了可视化的LAMP快速检测方法，

8、基于β-tubulin基因的胶孢炭疽菌LAMP检测技术具有良好的特异性，并且能区分敏感和抗药性菌株。在离体条件下，对抗药性治理药剂进行了筛选，确定了咪鲜胺-吡唑醚菌酯（1:3）和咪鲜胺-苯醚甲环唑（1:5）两种最佳复配方案。关键词：胶孢炭疽菌；甲基硫菌灵；吡唑醚菌酯；抗药性机制；环介导等温扩增（LAMP）；抗药性治理IABSTRACTABSTRACTAnth