基于核酸适配体的赭曲霉毒素a和伏马毒素b_1检测方法研究

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1、分类号—密级不保密ＵＰＣ５７７硕±学位论文基于核酸适配体的髓曲霉毒素Ａ和伏马毒素Ｂｉ检测方法研究作者姓名；桂海变指导教师；宋厚辉研究员学科专业名称；动物学研巧方向：动物疾病防控所在学院；农业与食品科学学院、动物科技学院论文提交日期：２０１５年６月８日浙江农林大学２０１５年６月８日ZhejiangA&FUniversityDissertationfortheDegreeofMasterDevelopmentoftheAptame

2、r-basedMethodfortheDetectionofOchratoxinAandFumonisinB1Candidate:GUIHai-luanAdviser:SONGHou-hui,ProfessorSpeciality:ZoologyDateofSubmission:June,2015ZhejiangA&FUniversityLin’an,ZhejiangProvince,P.R.ChinaJune,2015独创性声明（２０１２ＡＡ１０１６０）项目资助，本人声明，所呈交的学位论文，

3、是受国家高技术研究发展计划，，在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果并且是自己撰写的。尽我所知除了文中作了，也标注和致谢中己经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果不包一含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我同对本研究做出贡谢意，。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名日期：皆尘圣全＾句论文使用授权的说明本人完全了解浙江农林大学有关保留，、使用学位

4、论文的规定即学校有权送交论文的复印＾，＞件，允许论文被查阅和借阅；学校可＾公布论文的全部或部分内容可；＾采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。，在年后解密可适用本授权书。□保密＾不保密，本学位论文属于不保密。□＂＂（请在方框内打Ｖ）巳一批ｙｊ《少Ｉ三学位论文作者亲笔签名日期：ｐ匀、ｔ：曰期ｐ指导教师亲笔签名：ｙ；仁摘要摘要霉菌毒素是由真菌产生的一种具有毒性的代谢产物。赭曲霉毒素A（OTA）是存在于谷物、饲料等农产品中的一种霉菌毒素，而伏马毒素B1（FB1

5、）是主要存在于玉米及玉米制品中的一种致癌物。因此，霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。为此本文基于特异性核酸适配体建立OTA和FB1的检测方法。核酸适配体是一种特异性识别靶分子的单链寡核苷酸（RNA或DNA），具有较强的亲和力。PicoGreen是一种可以定量检测双链DNA且不受单链DNA影响的荧光染料，在激发波长480nm处有最大荧光。为了开发针对霉菌毒素的快速检测技术，本研究利用核酸适配体及PicoGreen染料的特点，建立了一种基于核酸适配体快速检测赭曲霉毒素A和检测伏马毒素B1

6、的方法。结果表明本研究建立的PicoGreen/适配体方法的最优反应缓冲体系为：10mmol/LTris，120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，20mmol/LCaCl2（pH8.5）。本研究使用的OTA核酸适配体序列为：5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAA-3'。该核酸适配体与OTA结合后，未结合的核酸适配体与互补链杂交生成双链DNA，PicoGreen与双链DNA反应3min后激发产生的荧光达到峰值（激发波长为480nm，发射波长为520nm

7、）。该方法检测赭曲霉毒素A的灵敏度为：1μg/L；检测范围为：1μg/L−200μg/L。OTA核酸适配体与黄曲霉毒素B1、伏马毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。本方法与基于抗体的ELISA方法符合（Kappa值为：0.885）。本研究利用FB1核酸适配体和PicoGreen建立检测FB1的方法，最低检测限为0.1μg/L，线性范围为0.1μg/L−1μg/L。整个检测流程可在45min内完成。特异性试验表明，适配体方法特异性强，与靶标霉菌毒素以外的常见霉菌毒素无交叉反应。结果表明适配体

8、方法与商品化的基于抗体的ELISA方法非常符合（Kappa值0.857）。由于核酸适配体比抗体成本低，检测时间短，本研究建立的基于核酸适配体的方法比ELISA方法更具有市场竞争性和推广应用价值。关键词：赭曲霉毒素A，伏马毒素B1，核酸适配体，荧光染料，快速检测。IABSTRACTABSTRACTMycotoxinisatoxicmetaboliteproducedbyorganismsoffungi.OchratoxinA(OTA)isamycotoxi