核盘菌转录因子ssmads1的表达及其互作蛋白筛选的研究

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1、核盘菌转录因子SsMADS1的表达及其互作蛋白筛选的研究Researchonexpressionandpartners’analysisoftranscriptionfactorSsMADS1inSclerotiniasclerotiorumon作者姓名：王雪亮专业名称：植物病理学指导教师：潘洪玉教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月1日II中文摘要中文摘要核盘菌转录因子SsMADS1的表达及其互作蛋白筛选的研究核盘菌(Sclerotiniasclerotiorium(lib.)deBary)是一种隶属于子囊菌门、盘菌亚门、柔膜菌目

2、、核盘菌科、核盘菌属的典型同宗配合子囊真菌，其宿主范围十分广泛，可危害450多种植物，是一类重要的植物病原真菌，由该菌引发的植物菌核病，每年都会对我国的农业经济造成一定的经济损失。因此，核盘菌的相关研究引起植物病理学家的广泛关注。作为真核生物体内重要的一类转录因子，MADS-box蛋白家族基因广泛存在于生物体中并参与调控多种细胞的功能，包括细胞识别、新陈代谢、细胞周期等。实验室前期研究表明，转录因子SsMADS1参与核盘菌的生长和毒力的调节。为明确SsMADS1及其互作蛋白在核盘菌菌丝的生长和致病力等方面的作用，本研究利用以下几个方面来建立

3、SsMADS1的作用机理与互作网络体系研究，通过明确该基因编码蛋白的亚细胞定位、互作蛋白研究，为深入探讨核盘菌的致病机制，有效防治菌核病提供科学依据。1.SsMADS1原核表达与亲和纯化。通过反转录RT-PCR扩增获得SsMADS1基因的完整开放阅读框，该基因大小为681bp，共编码226个氨基酸，分子量为25kDa，理论等电点为6.16。构建原核表达载体，经IPTG诱导后，使得SsMADS1的融合蛋白在表达宿主菌中大量表达，通过Ni-NTAAgarose亲和层析，获得大量纯化的SsMADS1融合蛋白。2.SsMADS1抗血清的制备。以大量

4、纯化得到的SsMADS1融合蛋白为抗原，通过实验动物的自身免疫作用，促使其产生了抗血清，通过琼脂免疫双扩散、Western-blot等两种实验方法进行特异性免疫检测，并间接ELISA进行抗血清的效价测定，结果显示所得的抗血清与SsMADS1融合蛋白特异性结合稳定效果良好，所获得大量特异性良好的抗血清为下一步的亚细胞定位和深入研究奠定基础。3.SsMADS1的亚细胞定位分析。通过生物信息学分析预测该基因定位于细胞核上。利用所制得的抗血清与目的蛋白特异性结合的特性，分别提取核盘菌总蛋白、核盘菌细胞质总蛋白和核盘菌细胞壁总蛋白，利用Western

5、-blot手段检测，V中文摘要结果显示在核盘菌总蛋白、核盘菌细胞质总蛋白中均有特异性条带，核盘菌细胞壁蛋白中没有特异性条带，即该基因蛋白主要存在于细胞质中。另一方面设计引物并进行特异性PCR扩增得到SsMADS1基因，结合本实验室所构建的亚细胞定位载体，构建目标基因亚细胞定位载体。利用农杆菌介导的方法，将构建完成的载体转化入烟草中，在荧光共聚焦显微镜下观察定位信息发现该基因定位于细胞核上。上述研究结果表明SsMADS1定位于细胞核上。4.SsMADS1互作蛋白的筛选。利用生物信息学分析Domain互作预测和STRING分析，并结合His-t

6、agPull-down进行SsMADS1互作蛋白的筛选，通过SDS-PAGE分离和气质联动检测鉴定相结合的方法，进行SsMADS1互作蛋白的进一步筛选与鉴定。结果表明SsMADS1主要与蛋白质合成酶、丝氨酸合成酶、以及蛋白酶等相互作用。5.酵母双杂交诱饵载体部分的构建。为进一步研究与SsMADS1互作的蛋白，本研究构建了SsMADS1的酵母双杂交诱饵载体部分，通过毒性测定、自激活检测等方法验证表明所构建的诱饵表达载体无自激活性可以进行下一步实验。为进一步筛选核盘菌cDNA文库、解析互作蛋白网络的验证提供了基础。本研究克隆核盘菌重要的一类转录

7、因子SsMADS1，成功制备了该蛋白的抗血清，预测和筛选了SsMADS1的互作蛋白，构建了酵母双杂交诱饵载体，并进行了亚细胞定位，上述结果有助于揭示核盘菌生殖发育机理，为菌核病的防治提供理论依据。关键词：核盘菌；转录因子；SsMADS1；亚细胞定位；互作蛋白VIAbstractAbstractResearchonexpressionandpartners’analysisoftranscriptionfactorSsMADS1inSclerotiniasclerotiorumonSclerotiniasclerotiorium(lib.)d

8、eBaryisatypicalhomothallicfungus,belongingtoAscomycota,Pezizomycotina,Helotiales,Scleroti