河北省苹果树腐烂病菌种类分析及分子检测体系的建立

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文河北省苹果树腐烂病菌种类分析及分子检测体系的建立学位申请人：刘钰娇指导教师：曹克强教授王亚南副教授学科专业：植物病理学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月三日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使甩过的材料。与我一同工作的同志

2、对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字曰期：年j)月r曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：知导师签名：签字日期：）卜年[月；；曰签字日期勿广年‘月y曰学位论文作者毕业后去

3、向：工作单位：电话:通讯地址：邮编：分类号：S432.1单位代码：10086密级：公开学号：2012288河北省苹果树腐烂病菌种类分析及分子检测体系的建立SpeciesanalysisandestablishmentofmoleculardetectionsystemonapplevalsacankerpathogensinHebeiprovince学位申请人：刘钰娇指导教师：曹克强教授王亚南副教授学科专业：植物病理学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月三日摘要河北省是我国苹果生产大省，苹果树

4、腐烂病在我国各苹果产区普遍发生，经常造成毁园，导致严重的经济损失。目前，河北省腐烂病菌种类尚不明确，且缺乏诊断无症状树体是否带菌的准确、灵敏的检测方法。本研究通过对ITS基因序列进行分析，初步明确了河北省苹果树腐烂病菌的种类和系统进化情况；建立了苹果树腐烂病菌巢氏PCR检测体系，初步揭示未显症果树带菌组织部位及显症果树病疤周围带菌情况。为苹果树腐烂病准确诊断和有效防治提供了理论依据。主要研究结果如下：1、明确了河北省苹果树腐烂病菌的种类。以采自河北省9个市12个县（区）的具有不同菌落颜色的31株腐烂病菌为研究对象，采用真

5、菌通用引物ITS1/ITS4对ITS基因进行PCR扩增、测序并构建系统发育树，分析河北苹果树腐烂病菌种类。31株腐烂病菌菌株rDNA-ITS序列长度范围为542~563bp，Blast分析表明，20株为Valsaceratosperma，11株为Valsamalivar.mali，系统进化树分析表明河北省苹果树腐烂病菌全部与Valsamalivar.mali，Valsamali和Valsacerastosperma聚在同一分支，属于同一种群。证明了供试河北省苹果树腐烂病菌为Valsamali。2、建立了苹果树腐烂病菌巢氏

6、PCR检测体系。首先通过比较改良CTAB法、快速盐提法、试剂盒法提取DNA浓度、纯度、电泳及PCR扩增效果，确定了适合苹果组织带菌检测的DNA提取方法。通过引物的设计、引物特异性测定、扩增体系的优化、灵敏度测定、可靠性验证构建了苹果树腐烂病菌的巢氏PCR检测体系。结果表明，改良CTAB法提取DNA的浓度为102.1~734.5ng/μL，A260/A280为2.06~2.29，电泳后有大于2000bp的条带，随机引物进行PCR获得了清晰稳定的扩增产物，是较适合苹果树木质部和韧皮部组织基因组DNA提取的方法。建立的巢氏PC

7、R检测体系将真菌通用引物ITS1/ITS4作为第一轮扩增引物，苹果树腐烂病菌ITS区特异引物V-F/V-R作为第二轮扩增引物，检测灵敏度达到了1fg/µL，能够用于苹果树腐烂病田间样本检测。为苹果树腐烂病准确诊断提供了可靠的方法，为病害防治奠定基础。3、揭示了无明显症状发病苹果树不同组织部位携带腐烂病菌情况，显症果树不同类型病斑周围带菌情况。通过对不显症苹果树主干、3年生枝条、2年生枝条、1年生枝条的韧皮部和木质部组织进行带菌情况的检测，发现不显症苹果树韧皮部组织带菌率较高，达60%，而木质部组织带菌率低，仅为5%。枝条

8、的生长时间与带菌情况未表现出明显的规律性。揭示了通过对新病斑、已治愈病斑、复发病斑这3种不同病斑周围0~6cm，每隔1cm韧皮部组织带菌情况进行检测，发现新病斑和复发病斑比已治愈病斑带菌范围大，至少能达到3cm，最远的能达到6cm，已治愈病斑可在0~1cm处检测到病菌，最多能达到4cm。关键词：苹果树腐烂病菌；种类分