体外诱导人脐带间充质干细胞、神经生长因子转染及向神经上皮祖细胞分化的实验研究

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1、上海交通大学硕士学位论文体外诱导人脐带间充质干细胞、神经生长因子转染及向神经上皮祖细胞分化的实验研究硕士研究生：张飞学号：1127249488导师:刘海涛申请学位：医学硕士学科：泌尿外科培养单位：上海交通大学附属第一人民医院基金项目：国家自然科学基金（81170701）答辩日期：2015年4月授予学位单位：上海交通大学DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofMasterNGFGENEOVEREXPRESSEDLENTIVIRALVECTORSTRANSFECTHUMANUMBILI

2、CALCORD-DERIVEDMENSENCHYMALSTEMCELLSANDITSDIFFERENTIATIONOFNEURALSTEMCELLINVITROCandidate：ZhangFeiStudentID:1127249488Supervisor：LiuHaiTaoAcademicDegreeAppliedfor：MasterofMedicalScienceSpeciality：UrologyAffiliation：ShanghaiFirstPeoplesHospitolSupportedBy：NationalNaturalScienceFoundatio

3、nofChina(GrantNo.81170701)DateofDefence：Apr，2015Degree-Conferring-Institution：ShanghaiJiaoTongUniversity上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文《体外诱导人脐带间充质干细胞、神经生长因子转染及向神经上皮祖细胞分化的实验研究》，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标

4、明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2015年5月1日III上海交通大学硕士学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2015年5月1日日期：201

5、5年5月1日IV上海交通大学硕士学位论文体外诱导人脐带间充质干细胞、神经生长因子转染及向神经上皮祖细胞分化的实验研究摘要目的：糖尿病神经源性膀胱（DiabeticNeurogenicBladder，DNB）是糖尿病引起的泌尿系统常见并发症，因临床治疗缺乏针对性，只能暂时缓解症状，不能中止DNB的进展和恢复膀胱功能。神经生长因子（NeuronGrowthFactor，NGF）减少是DNB重要的致病因素。临床试验证实补充外源性NGF可有效改善DNB，但也存在NGF半衰期短、生物利用度低等问题。人脐带间充质干细胞（HumanUmbilicalCordMesenchymal

6、StemCells，hUCMSCs）既具有多向分化潜能，又是一种良好的基因治疗的载体细胞。本课题拟在构建含人NGF的重组慢病毒载体并转染至人脐带MSCs的基础上，体外诱导分化含NGF的人脐带MSCs成为神经上皮祖细胞，使神经上皮祖细胞持续稳定表达NGF，从而使NGF和诱导分化后的人脐带MSCs分别发挥基因治疗和细胞治疗作用，为下一步的实验治疗奠定基础。方法：1.从新生儿脐带中提取hUCMSCs并鉴定其基本生物学特性，采用细胞计数仪计数制作生长曲线、流式细胞仪鉴定hUCMSCs细胞表面抗原，免疫荧光方法验证hUCMSCs的Nestin蛋白表达情况。2、诱导hUCMSC

7、s向成骨方向及成脂方向分化。检测胶原表达、茜素红染色及ALP并评价成骨分化效果。油红O染色评价成脂分化效果。从而验证hUCMSCs的多向分化能力。3、过表达NGF的慢病毒载体构建，筛选最佳MOI后使用慢病毒转染hUCMSCs。荧光显微镜拍照，估算转染效率。4、利用添加bFGF、EGF的无血清D/F12培养基，经过两个阶段诱导过表达V上海交通大学硕士学位论文NGF的hUCMSCs向神经上皮祖细胞分化，采用形态学观察、免疫荧光、RT-PCR、Western-Blotting、ELISA等多种方法评价诱导效果。结果：1、原代hUCMSCs细胞形态为长梭形，呈漩涡状、鱼