《新城疫病毒诱导宿主细胞应激颗粒形成机制的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号＾密级ＵＤＣ编号中国农业科学磅上巧兽医研究所博±后研巧工作报吿新城巧病毒诱导宿主细舱应激顆粒形成机制的研究孙英巧０３一２０工作完成日期２１年６月１５年８月巧告巧交日巧２０１５年９月上巧含医研究所（上巧）２０巧年９月 分类号密级ＵＤＣ编号中国农业科学晓上海宮医研究所博±后研究工作报告新城疫病毒诱导宿主细胞应激颗粒形成机制的硏究孙英杰２０一工作完成日期１３年６月２０１５年８月报告提交日期２０１５年９月上海兽医研究所（上海）２０１５年９月 新城疫病毒诱导宿主细胞应激颗粒形成机制的研究ＴＨＥＭＥＣＨＡＮＩＳＭＯＦＳＴＲＥＳＳＧＲＡＮＵＬＥＦＯＲＭＡＴＩＯＮＩＮＤＵＣＥＤＢＹＮＥＷＣＡＳＴＬＥＤＩＳＥＡＳＥＶＩＲＵＳ博±后姓名孙英杰一级学科流动站（）名称生物学专业（二级学科）名称微生物学研究工作起始时间２０口年６月２０日研究工作期满时间２０１５年８月２０曰上海兽医研究所（上海）２０１５年９月 独创性声明本人并明巧呈交的论文是我个乂在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽巧巧知，除了文中特别加从标注巧致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或摸写过的研究成果，也不包含为获巧中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所化的任何贡巧均己在论文中作了明巧的说明并表示了谢意。巧±盾签名：时间：年月曰３关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留：中国、使用学位论文的规定，即农业科学院有权保留送交论文的复巧件和樓盘，丸许论文被查巧和借阅，可从采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同竞中国农业科学院可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。博±后签名：斋时间：八ｚｒ年月＾日３？合作导师签名．滅时间：年月＾日Ｉ 内容摘要本文研究了新城疫病毒（ＮＤＶ）诱导应激颗粒（ＳＧ）形成及形成的机制，对病毒感染产生的ＳＧ中存在的特异性成分进行判定，Ｗ及阐明ＳＧ在病毒复制中发挥的作用，最后对ＳＧ如何调控病毒复制的机制进行深入探索。本文的主要结论是：１．ＮＤＶ感染能够诱导ＨｅＬａ细胞产生稳定的ＳＧ，且病毒的ＮＰ蛋白被特异性招募至ＳＧ中。２ＰＫＲ－．ＮＤＶ感染诱导总蛋白翻译水平的下降，病毒主要通过ｅＩＦ２ａ通路诱导ＳＧ形成。一些小核３．病毒感染诱导的ＳＧ需要持续的蛋白合成，并且包含糖体亚基Ｗ及翻译起始复合物前体成分。。４．病毒感染诱导形成的大ＳＧ依赖于微管蛋白的完整性－５．ＳＧ形成关键基因ＴＩＡ１和ＴＩＡＲ的敲低能够显羞抑制ＮＤＶ蛋白的表达及病毒释放，并且能够同时导致细胞总蛋白翻译水平上升。６．病毒感染诱导的ＳＧ中主要包含宿主的总ｍＲＮＡ，大部分病毒的恃异性ｍＲＮＡ逃逸ＳＧ包裹。关键词：应激颗粒，新城疫病毒，翻译，ＴＩＡ，ｍＲＮＡ Ａｂｓ化ａｃｔＭａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｒｅｓｐｏｎｄｔｏｖａｒｉｏｕｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙａｒｒｅｓｔｉｎｃｔｏｌａｓｍｉｃｍＲＮＡｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ｇｙｐ，ｐｅｌｅｍｅｎｔａｎｄＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｒｏｔｅｉｎｓｔｏｆｏｒｍｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｓＳＧｓ．Ｉｎｔｈｉｓｐｇ（）ｓｔｕｄｙｗｅｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａ化ｖｉｒｕｓ，ｉｅｃ－ＮＤＶ）ｎｄｕｃｅｄＳＧｓ．Ｎｅｘｔｗｅｅｘａｍｉｎｅｄ＆ｅｓｉｆｉｃｃｏｍｏｎｅｎｔｓｍＮＤＶ（ｐｐｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｗｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ也ｅｒｏｌｅｏｆＳＧｉｎＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｄ化ｅｃｏｎｃｒｅｔｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｈｏｗＳＧｒｅｇｕｌａｔｅｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｎｃｌｕｄｅ：－ｏｎｏｆＮＤＶｉｎｄｕｃｅｄｓｔａｂｌｅｆｏｒｍａｔｉＳＧｉｎＨｅＬａｃｅｌｌｓ．ＮＰｒｏ化ｉｎｗａｓｐｓｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｒｕｉｔｅｄｉｎｔｏＳＧｓ．ｐ－ｒｏＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｄｕｃｅｄｈｏｓｔｔｅｉｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｖｅｒ出ｅｔｉｍｅ．ＶｉｒｕｓｐｉｎｄｕｃｅｄＳＧｆｏｒｍａｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｔｈｒｏｕｇｈＰＫＲ／ｅＩＦ２ａａｔｈｗａ．ｐｙ－－ＮＤＶｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓｒｅｑｕｉｒｅｓｏｎｇｏｉｎｇｐｒｃｒｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｃｏｎｔａｉｎ化ｅｓｍａｌｌｒｉｂｏｓｏｍａｌｓｕｂｕｎｉｔａｎｄｋｅｙｃｏｍｏｎｅｎｔｓｉｎｅｕｋａｒｏ垃ｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｐｙｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｒｏｃｅｓｓｐ－村ｏｎＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｄｉｓｍｐｌｅａｄｓ化化ｅｆｂｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｍａｌｌＳＧｓｏｓｔＮＤＶｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ－ＤｅＩＡ－１ＩＡＲｌｅｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｅｎｏｕｓＴａｎｄＴｒｅｄｕｃｅｄＮＤＶｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｐｇｐａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｌｏｂａｌｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｎＨｅＬａｃｅｌｌｓｇｐ－ＮＤＶ－ｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓｃｏｎ记ｒｅｄｏｍｕｉｎｐｉｎａｎｔｌｙｃｅｌｌｌａｒｍＲＮＡｂｕｔ凸ｏｔｖｉｒａｌｍＲＮＡＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｔｒｅｓｓｇｒａｎｕｌｅ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ），ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓＴ－１ｌａｔｉｏｎＩＡｍＲＮＡ，， 目录一第胃绪论１１．１应激颗粒的形成机制１１．２ＳＧ成分的多样性２１．３病毒对应激颗粒的调节机制３－１．３．１病毒对ＰＫＲｅ圧２ａ通路的调控４‘‘’１．３．２病毒对ＳＧ核也蛋白的挟探６１．３．３病毒对ＳＧ组分的切割７１．４应激颗粒与先天性免疫９１．５结胃１０１．６本文工作简介１０１１第二章新城疫病毒感染诱导稳态应激颗粒形成２．１１１２．２材料和方法１１２；．２．１病毒和细胞；．．．．．１１２２Ｊ２抗体和试剂１１２．２．３免疫巧光检测ＳＧ的形成１１２．２．４ＳＧ点的计数１２２．３ＮＤＶ感染诱导稳定ＳＧ形成１２－２．４ＮＤＶ感染诱导ＳＧ标志物ＴＩＡ１和Ｇ３ＢＰ１共定位１４－２．５ＮＤＶＮＰ蛋白而非Ｐ蛋白与ＳＧ标志物ＴＩＡ１共定位１５２．６藏１６第Ｈ韋新城疫病奉通过ＰＫＲ／Ｃ圧２ａ诱导ＳＧ形成１８３．１前１８ｔ３．２材料和方法１８ ３．２．１病毒和细胞１８３．２．２抗体和试剂１８３．２．３质粒和干扰ＲＮＡ１９３．２．４免疫巧光；．．．．．．．１９３．２．５ＳＧ点的评数２１－ｂ３．２．６Ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ２１３．３ＮＤＶ感染诱导ｅ圧２ａ磯酸化和，总蛋白翻译水平下降２３３．４ｅ圧２ａ５１位磯酸化参与了ＮＤＶ诱导ＳＧ的过程２４３．５ＮＤＶ感染后病毒ｄｓＲＮＡ和ＰＫＲ巧位于ＳＧ中２５３．６ＰＫＲ参与了ＮＤＶ感染诱导的ｅＩＦ２ａ激活２６３．７ＰＫＲ干扰导致ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ点的减少２７３．８巧论２８第四章新城疫病毒感染诱导的ＳＧ为经典型ＳＧ２９４．１前胃；２９４．２材料和方法２９４．２．１病毒和细胞２９４２２．．抗体和试剂２９４．２．３药物试验３０４．２．４免疫炎光检测ＳＧ与特异性标志共定位３１４．３ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ可被放线菌爾降解３１４．４ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ与小核糖体亚基共定位３２４．５ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ与翻译起始因子共定位３３４．６農３５第五章ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ需要微管蛋白协助：．．．３７５．１Ｍｎ３７５．２材糾和方法３７５．２．１病毒和细胞３７ ５．２．２抗体和试剂３７５．２．３药物处理扣５．３ｔｕｂｕｌ虹介导ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ的聚集％５．４ａｃｔｉｎ与ＮＤＶ诱导的ＳＧ无关３９５５４１．＃论第六章ＳＧ通过调控蛋白翻译系统促进病毒复制４２６．１前胃．．．．．．．．二．…４２６．２材料和方法４２６．２．１病毒和细胞４２６．２．２抗体和试剂４３６．２．３干扰ＲＮＡ．．．．．．．４３，．１．‘６－．２．４干扰ＴＩＡ１／ＴＩＡＲ后检测蛋白翻译及病毒滴度４３６．２．５ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ条带灰度值计算４４６－．３ＴＩＡ１的干扰降低病毒蛋白翻译的同时増加细胞总蛋白的翻译４５６－．４ＴＩＡ１的干扰导致细施上清中病毒滴度的降低。４６＇６．５ＴＡＲ的干４７Ｉ扰降低病毒蛋白翻译水平和病毒滴度６．６讨论４９－第ｂ章ＳＧ主要包裹宿主总ｍＲＮＡ而非病毒ｍＲＮＡ５１７．１前胃５１７．２材料和方法５１７．２．１病毒和细胞５１７．２．２抗体和试剂５１７．２．３巧光原位杂交（ＦＩＳＨ）５２７ｍＲＮ－．３宿主总Ａ在ＮＤＶ感染后期与ＴＩＡ１共定位５２７．４宿主总ｍＲＮＡ在ＮＤＶ感染后期与ＴＩＡＲ共定位５４７．５職５５＾＾５７ ８ｇｃ谢５参考鏡５９１附录博后期间发表文章列表６６附录２博后期间申请课题列表６７ 第一章绪论当哺乳动物细胞受到热休克、氧化应激、营养缺乏或者病毒感染等环境压力时，能够迅速启动细胞的压力应答机制，终止细胞内一的蛋白翻译一一，在这个过程中，往往会形成种可逆的动态结构应激颗粒（ＳＧｓ）。它能够降低细胞整体的翻译速率。ＳＧ的形成是从停滞组装的４３Ｓ和４８Ｓ核糖体起始复合物的聚集开始的，它作为一个临时储存库来存放送些复合物，ｍＲＮＰ向应激颗粒中的聚集增レ加了细胞的存活几率，而当压力解除时，这些翻译复合物可ッ迅速被释放并恢复蛋白质的合成，从而恢复细胞内稳态。应激颗粒作为胞浆中终止活动的翻译起始复合物的聚集产物，在细胞的基因表达和内平衡中发挥着重要的作用。尤其是当病毒感染细胞时，应激颗粒的形成可使细胞的蛋白翻译水平大大降低，从而抑制病毒的复制。然而在病毒的长期进化过程中，也衍生出了对抗细胞压力应答的相应机制，有些病毒甚至可利用应激颗粒中包裹的沉默的转录本促进自身的复制。本文将着重就ＲＮＡ病毒对应激颗粒的调控Ｗ一综述及最近提出的压力应激与先天性免疫之间的关系做。１．１应激颗粒的形成机制最常见的触发应激颗粒形成的条件有氧化压力、营养缺乏或热应激压为一，此时种ｅＩＦ２ａ激酶（血红素调节抑制激酶ＨＲＩ；ＧＣＮ２；双链ＲＮＡ依赖性激酶ＰＫＲ或ＰＫＲ样内质网激酶ＰＥＫＲ）被激活，促使翻译起始因子ｅＩＦ２的ａ亚基被磯酸化，阻止了ｅ－－ＩＦ２Ｂ将ｅＩＦ２ＧＤＰ转变成ｅＩＦ２ＧＴＰ，从而将ｅＩＦ２Ｂ滞留于ｅＩＦ２一－－Ｍｅｔ－复合物之中，进步减少了翻译起始复合物ｅＩＦ２ＧＴＰｉ２ｔ＾＾ｔＲＮＡＭｅｔ，抑制细胞的翻译过程，造成大量核糖核蛋白的结合－聚集，最终形成应激颗粒（图１１）。其中，不同的蛋白激酶分别■被不同的压力源激活：当细胞处于热应激或缺铁情况时，ＨＲＩ被激，ＧＣＮ２活；当细胞营养缺乏时蛋白激酶被活化；当细胞面对蛋白平展或折叠错误的压力时，ＰＩＣＲ样内质网激酶（ＰＥＫＲ）则被激活；而通常病毒感染会因其双链ＲＮＡ的识别而触发ＰＫＲ的活Ｗ化，从而引起加２ａ的磯酸化。除了依赖于ｅＩＦ２ａ的磯酸化介导应激颗粒的形成之外，也有的是通过抑制ｅＩＦ４Ｇ或者ｅＩＦ４Ａ的功１ ４’７３ｔ能来抑制蛋白的翻译，从而诱导应激颗粒的聚集。应激颗粒的形成的分子机制包括下几个步骤；（１）几种关－．ＢＰ１ＴＩＡ１ＴＩＡＲ）的自键组分ＲＮＡ结合蛋白（包括Ｇ３，，身低聚化；（２）蛋白翻译后的修饰；（３）ｍＲＮＰ在微管上的运输。应激颗粒包涵了数百种一百种基民ＮＡ互作的蛋白，更有研究显示超过因参与了ＳＧ的装配，因此ＳＧ形成的机制是多种多样且相当复杂Ｗ单的病毒却进化出了能够有效的。但仅仅携带了有限的基因的简控制应激颗粒形成与功能的机制。＂＂＂＂＂＂＇ＡＭＡｋＡＪｋ＾＂赛Ｖ＾／ｔｒ＊Ｒ？Ｕ成ｏｎ：．了。。Ｗａｉｏｗ：＾Ａｔ谷〇／＼巧斌ｆｆＮｏｒｍａｌＳｉｒｅｎｓｊＡＡｉＵＵｉＡＡＡＡＡＡＡ４８Ｓｌｃｏｍｐ６《＾＊ＳｔｒｅｓｓＧｒａｎｕｌｅ－图１１应激颗粒的形成机制－ｈｅｈａｎＦｉ．１１ＴｍｅｃｉｓｍｏｆＳＧｆｏｒｍａｔｉｏｎｇ１．２ＳＧ成分的多样性应激颗粒的形成是从停滞的翻译起始复合物的聚集开始的，２ 典型的应激颗粒Ｗ几种关键的翻译起始因子（例如ｅＩＦ４Ｅ，ｅＩＦ４Ｇ，ｅＩＦ４Ａ，ｅＩＦ４Ｂ，ｅＩＦ３，ｅＩＦ２，ＰＡＢＰ等）、ｍＲＮＡ和４０Ｓ核糖体亚基的高Ｐ’Ｗ浓度聚集为形成标志。此外，还有许多ＲＮＡ结合蛋白如ｃａｐｒｉｎｌ、ＦＭＲＰ、ＹＢ１、ＨｕＲ、ＴＴＰ等，可能只要是能够与ＲＮＡ结合的蛋白，或者可ｙＸ强烈的与ｍＲＮＰ互作的蛋白都会存在于ＳＧ中。而这些蛋白大多数都只是暂时储存于ＳＧ中，并无特殊的生物一学功能与意义。应激颗粒中也包含了些与它的形成密切相关的重要的标志蛋白，特别是Ｇ３ＢＰ１、ＴＩＡ１、ＴＩＡＲ、ＴＤＲＤ３、ｉｗｓｎｔｉＨＤ乂Ｃ６和Ｃａｐｒｉｌ。迄今为止的研究结果表明；在研巧病毒一与应激颗粒的相互作用过程中，些标志蛋白在细胞质中的聚一一集，并不定就是应激颗粒，即某两种应激颗粒的标志蛋白的ｔＷ聚集，弁不能断定为具有功能的应激颗粒的形成。在应激颗粒中有许多标志性成分，这些成分与其形成及功能具有很大的联系，并且存在于各种压为刺激下产生的颗粒中，但是应激颗粒的其他组成成分却会因为不同的压力刺激而不同。－例如，热休克引起的应激颗粒（ＨＳＳＧｓ）中特异性存在热休克蛋２７（ｈ２７）－白ｓｐ，而这个蛋白在亚神酸钢诱导的ＳＧ（ＡｒｓＳＧ）中就９Ｉ３１７ｔ；；］亚砸酸盐诱导的ＳＧ中存在太多数典型的翻译因不存在。ｔＷ子，但却唯独缺乏翻译起始因子ｅＩＦ３ｂ。病毒感染引起细胞压力十分特殊－ＳＧＳａｍ６８蛋，在这类病毒感染性应激颗粒（Ｖ）中存在－ＳＧｓ中并白，而此蛋白在ＨＳ没有发现由此可见，尽管应激颗粒作为细胞压力应答机制的重要组成部分，存在于各类哺郭动物细胞中，发挥着相似的功能，但其组成成分却不尽相同。１．３病毒对应激颗粒的调节机制病毒感染细胞后干扰了宿主的多项进程，从而激活了细胞的压力应答。尽管许多病毒在早期感染确实可引起应激颗粒，但是大多数病毒则可在某些感染周期中抑制应激颗粒的产生。另一外值得提的是，在己知的例子中几乎不存在具有功能的应激颗粒（包涵有停滞翻译的复合物）存在于细胞的同时，病毒仍然可高效率的复制一。这意味着病毒和应激颗粒之间存在着种敌对性的关系，这也更加便于我们理解人们对应激颗粒的功能性定义一一具有翻译沉默和ＲＮＡ降解的功能的蛋白聚集颗粒。３ 前面讨论到应激颗粒的形成方式多种多样，因此不难推出病毒对应激颗粒的调节也存在着许多不同的方式。为了便于理解，下面的讨论将根据病毒与应激颗粒互作的机制不同分成下Ｈ类－ＩＦ２ａ通；（１）病毒对ＰＫＲｅ路的调控；（２）病毒对ＳＧ核也蛋白＂＂ｔＷ的挟持；（３）病毒对ＳＧ姐分的切割。由于这些互作大部分是对病毒系统的初步探索，有些甚至存在着争议，因此这种分类还－有待验证（图１２）。ｓｔｒｅｓｓｇｒａｎｕｌｅ＼〇Ｚ？＼ｋ４－Ａｐ５＂舖为Ｔ＂ｎ贴於Ｊ端哉ｖＬ兔＂為ｆｒ背他Ｖ媒．Ｕ＊、ＡＣＴＩＶＥＰＯＬＹＳＯＭ６。：ｃｒｉ＾；ｄｒｉｓｖｉｒｕｃｅｔｐａａｌｓｓｙ＾／ｏｌｉｏｖｉｒｕｐｓ、偷Ｊｆ；－冷巧尋茶＾防化Ｄｅ？ｃａＤｅｎｇｕｅｗ／ｄｙｖｉｎ／ｐｏｖｔｒｕｆ＾）６ｓ图－２病毒对应激颗粒的调节机制１－Ｆｉ．１２ｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅａｓｓｅｍｂｌａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｖｉｒｕｓｅｓｇｇｙｙ－ｅ１．３．１病毒对ＰＫＲｌＦ２ａ通路的调控ＰＫＲ是细胞在受到压力刺激和病毒感染时激活压力应答和先一天性免疫的个重要的传感器。大多数的动物病毒都可Ｗ触发ＰＫＲ的活化，并且许多病毒也存在着抵抗ＰＫ艮活性的机制，这些机制也会对应激颗粒的形成产生影响。ＰＫＲ的激活和由此产生的翻译抑制可Ｗ强烈诱导ＳＧ形成，但是ＳＧ通过Ｇ３ＢＰ诱导的４ ｍＲＮＰ的聚集也引起一些病毒也可通过折ＰＫ民的活化。这可能是叠蛋白反应来激活ＰＥＲＫ，并同样导致下游ＳＧ形成，但送之间的直接联系目前尚未见报道。在普通感染情况下，Ａ型流感病毒（ＩＡＶ）可Ｗ通过病毒蛋白ＮＳ１的活化来阻止应激颗粒的产生，而ＮＳ１蛋白可被自身具有双链ＲＮ乂绑定结构域而活化，从而抑制ＰＫＲ憐酸化的作用。然而，对不能绑定双链ＲＮＡ的ＮＳ１蛋白突变体的表达，却可引起ｅＩＦ２ａ的磯酸化，并引起ＳＧ的聚集。当ＳＧ形成后，通过对病毒蛋白ＮＰ的检测，可Ｗ得知，病毒的复制受到了抑制。此外，用ＰＷＮＳ１突变的病毒感染ＰＫＲ敲除的细胞系并不能形成应激颗粒，这表明了ＮＳ１对ＰＫＲ的活性的抑制，是ＩＡＶ抑制应激颗粒形成的关键。同样，巧缺失ＮＳ１的病毒感染细胞可Ｗ形成应激颗粒。ＮＳ一１蛋白对应激颗粒的抑制机制包括了它与细胞个包括ＲＮＡ结ＰＵ合蛋白５５（民ＡＰ５５）的复合体的互作。ＲＡＰ５５既存在于应激颗粒中也存在于Ｐ小体中，并且可能促进ｍＲＮＰ在他们之间的穿梭功能。过表达民ＡＰ５５可Ｗ引起应激颗粒，并且抑制病毒的复制。当ＮＳ１蛋白缺失时，病毒的ＮＰ蛋白与应激颗粒共定位，但是在野生型病毒感染时一些又争议的，则转而与Ｐ小体共定位。而在报道中显示：使用缺失了ＮＳ１的突变体病毒感染细胞，仍然引起了ＰＫＲ的活化，ｅＩＦ２ａ的磯酸化和应激颗粒的形成，但是ＮＰ蛋白Ｐ２３的复制并没有发生改变。这表明了，可能不仅仅是不同种的应激颗粒存在组成成分的差异，即使是同种病毒感染不同种类型的细胞也会存在差异（Ａ５４９细胞与ＨｅＬａ细胞）。轮状病毒的病毒蛋白Ｐ２、ｎｓＰ２和ｎｓＰ５可Ｗ积极促进ＰＫ民和ｅＩＦ２ａ的磯酸化，从而控制宿主细胞的翻译系统，但这种磯酸化并Ｐｓ不穀响病毒自身蛋白的合成ｉ。用亚神酸钢刺激感染了轮状病毒，的细胞并不能观察到应激颗粒的形成，由此可见轮状病毒的感染可＾＾＾抵制细胞受到的外源性压力刺激，但这之间的作用机制尚不明确。哺乳动物正呼肠孤病毒（ＭＲＶ）在感染早期（６小时）可Ｗ诱导应激颗粒的形成，使得ｅＩＦ２ａ的磯酸化增强，并使细胞内整体的蛋白翻译受到抑制有研究表明，ＭＲＶ诱导的ＳＧ的形成并非依靠某一种蛋白激酶的活化来促进ｅＩＦ２ａ的憐酸化，而是通过多条５ Ｐ５３途径激活该反应。而在ＭＲＶ感染的晚期，虽然仍旧能使ｅＩＦ２ａ的憐酸化，但是ＳＧ的数量明显减少，并且细胞开始优先翻译病毒ｓｐ一ｍＲＮＡｉ的。很有可能ＭＲＶ存在着另外条不依赖ｅＩＦ２ａ的磯酸化的通路，但这种猜测还有待验证。丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）同样是依赖ｅＩＦ２ａ的磯酸化诱导应激颗粒的形成丙肝病毒复制极其缓慢，并且可Ｗ持续改变其一一对应激颗粒的调控方式：边组装，边拆卸，使得细胞内的蛋白表达处于抑制和未抑制的动态变化之中。对于应激颗粒的拆卸，丙肝病毒是通过ＧＡＤＤ３４介导的ｅＩＦ２ａ的去磯酸化来实现的２６［］〇传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）和小鼠肝炎冠状病毒（ＭＨＣ）均属于冠状病毒属，在早期感染过程中均可形成包含有ＴＩＡ民的应激颗粒目前还没有证据表明ＴＧＥＶ可Ｗ在感染后期分解应激颗粒。在干扰了ＳＧ的组分ＰＴＢ后，病毒的蛋白的复制增加，ＰＷ证明应激颗粒的产生可Ｗ抑制ＴＧＥＶ的复制。同样，在ＰＫＲＰ９］Ｓ５１Ａ突变体小鼠成纤维细胞中，ＭＨＶ的复制也显著增强。＂＂１．挟持．３２病毒对ＳＧ核心蛋白的大多数的应激反应都可从多个层次来调节细胞的基因表达，其中最显著的是调控蛋白翻译和ＲＮＡ降解。在最初期的病毒蛋白合成后一个招募核糖体，正链ＲＮＡ病毒必须将个体基因组从的状态转变成抑制翻译的状态，此将核糖体从模板上清除，Ｗ便于ＲＮＡ的复制。因此，细胞质中存在着多，在病毒复制过程中一些关键因种ＲＮＡ调控蛋白也就不足为奇了。如果说应激颗粒的一起子，如Ｇ３ＢＰ１、ＴＩＡ１必须聚集在，才能促使应激颗粒形成，那么，病毒就可Ｗ通过对这些宿主因子的调控，来重新改变宿主利用这些因子所想达到的功能和效果。一些甲病毒属病毒的非结构蛋白可，［＾与Ｇ３ＢＰ１互作形成复ＰＷＡｌ合物，例如塞姆里斯森林病毒（ＳＦＶ）。在ＳＦＶ感染早期可ＷＰＳ３使ｅＩＦ２ａ磯酸化，诱导应激颗粒的形成，而到了后期则可抑制其形成。ＳＦＶ的ｎｓＰ３可将Ｇ３ＢＰ１蛋白包裹在病毒复制复合物ＰＷ，Ｃｈｉｋ中，从而抑制了应激颗粒的形成。与之相似ｕｎｇｕｎｙａ病毒的ｎｓＰ３蛋白也同样可［＾通过招募Ｇ３ＢＰ１蛋白到新型的细胞质颗粒６ 中来抑制应激颗粒的形成。这两种病毒ｎｓＰ３的蛋白与Ｇ３ＢＰ１与的互作结构域均存在于其幾基端，但其具体位置却不同。另外，ＳＦＶ在靠近翻译起始密码子的区域存在翻译增强子，可逃避ｅＩＦ２ａ磯ＰＷ酸化导致的翻译抑制作用，并且有利于巧分应激颗粒。辛德毕斯病毒（ＳＢＶ／ＳＩＮＶ）同样属于甲病毒属，其ＲＮＡ依３１］赖的ＲＮＡ聚合酶ｎ［ｓＰ４蛋白可［＾与Ｇ３ＢＰ１和Ｇ３ＢＰ２互作而Ｇ一３ＢＰ１又可与ｎｓＰ２和ｎｓＰ３互作，因此就形成了个复杂的病Ｐ２＾３３３毒蛋白酶复合物。在缺乏Ｇ３ＢＰ１的情况下，病毒的ＲＮＡ水平并没有发生较大的改变，但病毒多聚蛋白水平却显著上升。这表明了Ｇ３ＢＰ１对病毒翻译的影响远远大于对ＲＮＡ复制的影响。黄病毒属的西尼罗河病毒（ＷＮＹ）和登革热病毒（ＤＥＮＹ）Ｐ７３＂’’同样可抑制亚神酸钢诱导的ＳＧ的形成。而这种挟持机制涉及了多个ＳＧ成核的关键蛋白，如ＴＩＡ１、ＴＩＡ民和Ｇ３ＢＰ１。研究表明，西尼罗河病毒不能诱导ＳＧ产生的原因很有可能是赋予了’ＴＩＡ民新的功能—促进自身病毒复制病毒的３端的茎环结构可与ＴＩＡ１和ＴＩＡ民结合，并与细胞核周围的复制酶富集区共Ｐ７３定位，Ｗ此来促进病毒的复制。由此可见，病毒对ＳＧ成核的关＂＂可防止应激颗粒的形成键蛋白的挟持，促进自身的复制。之前提到的丙型肝炎病毒可［＾通过调控ｅＩＦ２ａ的磯酸化来控制＂＂来应激颗粒，同样，它也可Ｗ通过对应激颗粒成分的挟持调控应激颗粒的形成。丙肝病毒可在细胞质形成新型的蛋白聚集，这其中包括了Ｇ巧Ｐ１、ＤＤＸ６、民ＣＫ／ｐ５４、Ｘｍｌ等，它们在感染后期与丙肝病毒的核也蛋白共定位成环状。而通过干扰ＤＤＸ６、ＧｔＷ３ＢＰ１等，ＨＣＶ的复制水平也显著下降，这说明了病毒利用了应激颗粒及Ｐ小体的成分蛋白来帮助自身的复制。？１．３．３病秦对ＳＧ组分的切割许多的正链ＲＮＡ病毒可通过表达一些病毒蛋白酶来裂解宿一主的些重要的蛋白，只，Ｗ此来调节细胞内环境。迄今为止有肠病毒（如脊髓炎灰质病毒）已被证实能够利用蛋白酶来降解细胞ＲＮＡ颗粒的相关因子。脊髓炎灰质病毒可Ｗ在感染的早期阶段－形成病毒感染性应激颗粒（ＶＳＧ），但到了病毒感染的中后期，病毒就会抑制并分解应激颗粒。应激颗粒的分解机制包括了病毒３Ｃ７ 蛋白酶对应激颗粒成核蛋白Ｇ３ＢＰ１的切割。Ｇ３ＢＰ１的切割将其氨基端的蛋白互作结构域和簇基端的ＲＮＡ识别区域分开，从而破坏了它对应激颗粒形成的聚集作用。在病毒感染后期，通过表达抑制３０蛋白剪切０３８？１的蛋白突变体可＾＾产生应激颗粒，这表明ｉ７４＾Ｗ一ｆ些与之相矛盾的了Ｇ３ＢＰ１在应激颗粒形成中的重要性。而研究结果显示一，在些病毒刺激性应激颗粒中直到病毒感染的后ｉ７ＴＡｔｌ期仍然可Ｗ检测到应激颗粒的标志分子Ｉｌ，而随后，人们发现在这些颗粒中往往缺乏翻译因子ｅＩＦ３、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４ＥｔＵ及ｍＲＮＡ。这表明了在Ｇ３ＢＰ１被切割后残余的ＴＩＡｌ颗粒并不是传统意义上定义为富集了失速的翻译起始复合物并能够抑制细胞翻３ＢＰ１来译的应激颗粒。因此，脊髓炎灰质病毒可能是通过切割Ｇ将ＴＩＡ１从凝集了翻译起始因子的应激颗粒中拆分开来。这些发现说明了病毒感染引起的应激颗粒在功能和结构上都存在着各种差异，因此并不能仅仅通过对几个应激颗粒的标志分子的研究就得出可靠的结论。脊髓灰质炎病毒感染可诱导ｅＩＦ２ａ的磯酸化，与此同时可通过诱导应激颗粒的形成来限制细胞的蛋白合成系统，从而抑制病毒ＲＮＡ的复制。而有趣的是，脊髓炎灰质病毒可＾通过３Ｃ蛋白酶切割ｅＩＦ５Ｂ来越过在翻译起始时对ｅＩＦ２ａ的依ｔｗ赖，但是这对于应激颗粒的形成并没有多大的影响。在小核糖核酸病毒总科中，有另外两种病毒也可表达３Ｃ蛋白酶（具有不同的切割特异性），它们同样可Ｗ抑制应激颗粒的形成，但是并未见有报道称是切割应激颗粒的重要蛋白来发挥送样一的作用。Ｔｈｅｉｌｅｒ氏鼠脑脊髓炎病毒（ＴＭＥＶ）也可Ｗ通过种未知的病毒蛋白来抑制应激颗粒的形成，并且在感染过程中这种蛋４２［］白能够保持Ｇ３ＢＰ１的完整性。Ｃｒｉｃｋｅｔａｒａｌｓｉｓｖｉｒｕｓ是小核糖ｐｙ一核酸病毒亚族的成员之３ＢＰ１ＴＩＡ－１，它也可Ｗ在不切割Ｇ和的ｎ－（Ｒｉ８ａｎｄ民０Ｘ）的情况下感染后两小时就抑旁系同源基因，在制应激颗粒的形成。病毒的３Ｃ蛋白酶在细胞受到压力的情况下是游离的，而在病毒感染情况下则并非如此，表明还有其他的病毒４３ｔ３蛋白影响着它的亚细胞定位，也预示着可能还存在着别的未知的重要的应激颗粒蛋白分子被切割。８ １．４应激颗粒与先天性免疫最近，有观点认为细胞面对病毒感染产生的压力环境时的压力应答在很多层面上都与先天性免疫具有着重要的联系。压力应答的过程中，或多或少都会有先天性免疫相关蛋白成分的参与，而这其中，有些蛋白成分还起到至关重要的作用。ＰＫＲ一个典型的干扰素应答蛋白分子是，它能够与病毒的ＲＮＡ结合，感知细胞内病毒核酸的存在情况，介导下游的干扰素反应。与此同时，ＰＫＲ的活化诱导了ｅＩＦ２ａ的磯酸化，阻滞了细胞内的翻译进程，引起应激颗粒的产生。在对许多病毒的研究中，人们都发现缺失了ＰＫＲ的ＭＥＦ细胞失去了产生应激颗粒的能力，由此可ｙＡ看出ＰＫ民在细胞压力应答中的重要地位。更有研巧表明，ＰＫ民还参与细胞的生长调控，它可憐酸化膜岛素受体基＾Ｗ质化Ｓｌ，从而参与细胞新陈代谢。此外，ＰＫＲ在细菌和双链ＲＮＡ病毒感染时，还可激活炎性小体和巨唆细胞的应答作用，－ｌｂ和ＨＭＧＢ１的释放引起细胞因子正。在先天性免疫的转录应４６＾４７ｔ３答中，ＰＫＲ也发挥着重要作用。由此可见，多种细胞内的营养应答与病原免疫反应都可通过ＰＫＲ这样的效应蛋白相互关联。最新的研究表明一些蛋白的，细胞的压力应答，往往会通过聚集而与先天性免疫相关联－－。民ＩＧＩ样受体（ＲＩＧＩ、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２一）是先天性免疫中识别ＲＮＡ病毒的类重要的模式识别受体，可介导干扰素的产生，从而发挥抗病毒的作用。而在对细－胞压力应答的研究中，人们发现在用亚神酸钢刺激细胞后，ＲＩＧＩ样受体可レッ进入应激颗粒之中。同样，用缺失了ＮＳ１的突变体流－感病毒感染细胞后，民ＩＧＩ样受体同样可被包裹入应激颗粒之中。但这种互作和共定位能够发挥什么样的功能，目前仍旧不是十分清楚。在对缺失ＮＳ１的突变体流感病毒的研究中，甚至发现病毒的ＲＮＡ也进入了应激颗粒之中而其他的病毒，如脊髓炎灰质病毒的ＲＮＡ则不能进入病毒感染诱导的应激颗粒之中，在送之中，某些被突变的病毒蛋白（如流感ＮＳ１蛋白）可能对应激颗粒的形成、组分及功能发挥着重要的影响。综合这类研究，我们不难发现，，细胞的压力应答在各种方面都与先天性免疫有着千丝万缕的联系，而这其中的机制目前仍９ 旧不甚明朗，有待于后期的研究来揭示细胞中各类先天性免疫信号通路与细胞压力应答之间的联系及其在功能上的相互影响。１．５结语在病毒感染引起的细胞各类应答反应中一，压力应答仍旧是类相对较新的领域。虽然目前已经有大量的关于各类病毒对应激颗粒操纵的报道，但是目前人们对这其中的作用机制仍然知之甚少。当细胞面对压力环境材，细胞内的应答反应是广泛且复杂的，它能够动员起细胞内的各种成分来调控ｍＲＮＡ的活化与沉一默，使么处于种最优化的动态平衡么中。而病毒，作为引起细胞压力环境的强大酌诱因，往往也能够迅速调集这些细胞内的变化情况，进化出多种机制抵抗细胞对它的抑制，甚至直接利用细胞的这种应激来帮助自身的复制。由于应激颗粒形成机制的复杂性。目前我，我们至今仍未能完全了解应激颗粒形成的具体过程们知道的关于病毒对应激颗粒的作用机制仅仅是由各类研巧结果一个完整的机制系统拼凑而成，并不能形成。此外，ＳＧ形成后产生的各类压力信号介导先天性免疫的抗病毒反应的机制也需要引起更对的重视。目前己知ＳＧ在许多层面上都与先天性免疫相互关键，因此，在对于应激颗粒的研究中可能一些在抗病毒治疗中具有价值的广谱的作用位点会发现。１．６村工作简介ＮＤＶ感染Ｈ一ｅＬａ细胞后ＳＧ形成的判定，进步对ＮＤＶ通过何种通路影响ＳＧ进行探索；对ＮＤＶ诱导ＳＧ中具体成分进行分析一；对ＳＧ在ＮＤＶ复制过程发挥的具体作用进行判定，进步解释其中的机制：在鸡成纤维细胞中病毒感染诱导ＳＧ形成进行初步探索。１０ 第二章新城疫病毒感染诱导稳态应激颗粒形成２．１前言哺乳动物细胞在受到各种环境压力，例如氧化应激、热休克或ＵＶ照射等情况下能够暂时进入一个相对稳定的蛋白翻译抑制的状态，Ｗ度过危机。在这种情况下，细胞内的应激颗粒（ＳＧ）形成Ｗ招募细胞质中未翻译的ｍＲＮＡ，蛋白翻译因子和ＲＮＡ结合蛋白一等。对细胞来说病毒感染也是种重要的生物学刺激，病毒感染和ＳＧ形成的状态根据病毒的种类不同而不同，本章中，我们对ＮＤＶ感染诱导细胞ＳＧ状态进行研究，并且对ＳＧ中病毒成分进行分析。２．２材料和方法２．２．１病毒和细胞新城疫病毒Ｈｅｒｔｓ／巧毒株由中国兽药监察所提供。将各毒株尿°囊腔接种９日龄ＳＰＦ鸡化在３７Ｃ培养箱中培养，３天（ｄ）后收集尿囊°－液血凝实验检测病毒滴度分装冻存于７０Ｃ冰箱中。在鸡胚成纤维，，４８ｆ３－细胞系（ＤＦ；ｌ中进行病毒的ＴＣＩＤ５０伴数细胞感染量）的测定。人）宫颈癌细胞系（ＨｅＬａ）购自中科院细胞库。２．２．２抗体和试剂羊－１ｌ－－１－ＴＩＡ多克隆抗体（ｇｏａｔｏｌｙｃｌｏｎａａｎｔｉＴＩＡ，ＳＣ１７５Ｔ）购ｐ自美国Ｓａｎｔａｃｒａｚｅ公司；鼠Ｇ３ＢＰ１单克隆抗体（ｍｏｕｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎ－ｔｉＧ：３ＢＰｌａＷ６５７４）购自美国Ａｂｅａｍ公司；ＤＡＰＩ购自碧云天生，物技术有限公司；小鼠抗核蛋白（ＮＰ）憐蛋白（Ｐ）单克隆抗体由本实验室制备。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记羊抗蘭ＩｇＧ购自美国ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ公司。红色及绿色巧光二抗购自美国１报公司。２．２．３免疫巧光检測ＳＧ的形成５１）将ＨｅＬａ细胞＾１０个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中（培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基１１ °在３７（３、５％（：化细胞培养箱中培养至７０％，２４１１后，切无血清培养ｅｒｔ基洗緣细胞３次，加入Ｗ无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｓ／３３毒株°ＩｍＬ１Ｍ０Ｉ（，３７Ｃ吸附Ｉｈ后，去，病毒感染量为多重感染复数）掉病毒液，［＾无血清培养基洗緣细胞３次，加入含１０％ＦＢＳ的°ＤＭＥＭ培养基在３７Ｃ、５％０化细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性和阳性对照组细胞，其它处理方式，阴性组除不感染ＮＤＶ外一致与病毒感染组。２）ＮＤＶ病毒感染３、６、９、１２、２４ｈ后，去掉培养基，ＰＢＳ洗緣细胞２次，加入４％中性甲酵室温固定２０ｍｉｎ，再ＷＰＢＳ洗络细胞３次。３）在湿涧的滤纸上放置保鲜膜，在保鲜膜上滴加１００叫＾１：１０００ＴＢＳＴＩＡ－１多克隆抗体稀释的，再放上含有细胞的飞片，保证抗体°与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ赔育Ｉｈ后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。４）在保鲜膜上滴加１００神＾１：２００ＴＢＳ稀释的驴抗羊焚光二抗，°再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ避光赔育比后，取出飞片，ＴＢＳ洗緣３遍。５３－４）重复步骤，对第二种抗体进行染色（ＮＰ或（ＢＢＰ１）６）在载玻片上滴加封片剂，然后放上含有细胞的飞片，用激光共聚焦显微镜观察、摄片。２．２．４ＳＧ点的计数通过对１０个随机的２００倍放大的视野进行ＳＧ计数判定ＳＧ形成状态。视野中的细胞数通过细胞核计数完成，感染细胞通过病毒ＮＰ蛋白计数完成－１，ＳＧ形成细胞通过ＴＩＡ或Ｇ犯Ｐ１计数完成。２．３ＮＤＶ感染诱导稳定ＳＧ形成为了研究ＮＤＶ感染后不同时间点ＳＧ的形成情况，我们１个感染复数（ＭＯＩ）的ＮＤＶ感染ＨｅＬａ细胞，在感染后不同时间点固－１定，间接免疫焚光染色观察病毒蛋白ＮＰ与ＳＧ特异性标志物ＴＩＡ的共定位，结果显示：病毒ＮＰ蛋白在ＮＤＶ感染后化即可被检测ＩＳＧ至Ｊ，但化时细胞中没有形成，ＳＧ在病毒感染后化出现，且与－２４ｈ逐渐增加ＮＰ有部分共定位，ＳＧ在ＮＤＶ感染后６，放大图片显１２ －示：部分ＮＰ蛋白与ＳＧ标志物ＴＩＡ１共定位，但还有部分ＮＰ蛋白－１不存在于ＳＧ中（图２）。对十个视野进行ＳＧ计数分析，结果盈示ＳＧ随着病毒感染时间增多（图２－２）－ＮＰＤＡＰＴＩＭｅｒＩＡ１ｇｅ田．．ＥＩＨＩＱｍｍｍｍ■■ｍｍｍｍ１３ ■图２－１ＮＤＶ感染ＨｅＬａ细胞诱导稳态ＳＧ形成ｉ－ｉｔｎｎＦ．２１ＮＤＶｎｆｅｃｉｏｎｌｅａｄｓＵ）ｔｈｅｓｔａｂｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｏｆＳＧｓｉＨｅＬａｇｃｅｌｌｓ１００－］ＳＩ８。１ＩＴ６。ＩＩＩ曲０３６９１２２４－２图２ＮＤＶ感染ＨｅＬａ细胞诱导ＳＧ点计数－２ｕａｎｔ－Ｆｉｇ．２Ｑｉ扫ｃａｔｉｏｎｏｆＮＤＶｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓｉｎＨｅＬａｃｅｌｌｓ２ＤＶ－．４Ｎ感染诱导ＳＧ标志物ＴＩＡ１和Ｇ３ＢＰ１共定位一－为了进步确证ＮＤＶ感染诱导的是否为ＳＧ，我们用ＴＩＡ１和Ｇ３ＢＰ１同时作为ＳＧ指标观察ＮＤＶ感染后是否ＴＩＡ－１和Ｇ３ＢＰ１共定位－１。结果显示；ＮＤＶ感染的ＨｅＬａ细胞中ＴＩＡ与Ｇ３ＢＰ１发生明盈的共定位现象（图２－３）ＮＤＶ感染诱导的点状聚集确实为，说明ＳＧ特异性聚集。１４ ＊■＂－ＴＩＡ１Ｇ化Ｐ１ＤＡＰＩＭｅ巧ｅ■ＨＢ图２－３ＮＤＶ感染ＨｅＬａ细胞导致ＴＩＡ－ｌ和ＣＢＢＰｌ的共定位－Ｆ－ａｎｎａｎｄｉｇ．２２ＴｈｅｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｔｔｅｒｂｅｔｗｅｅＴＩＡ１Ｇ３ＢＰ１ｉｎｐ－ｉｎｆｅｃｔｅｄＮＤＶＨｅＬａｃｅｌｌｓ２－．５ＮＤＶＮＰ蛋白而非Ｐ蛋白与ＳＧ标志物ＴＩＡ１共定位图２－１的结果显示，ＮＤＶ的部分ＮＰ蛋白在感染后期与ＳＧ特异性成分ＴＩＡ－１共定化提示病毒蛋白可能参与了ＮＤＶ感染诱导ＳＧ的形成过程。为了研巧病毒ＮＰ蛋白进入ＳＧ是否为普遍现象，我们将病毒ＮＰ和Ｐ蛋白分别与ＳＧ标志蛋白ＴＩＡ－１和ＧＢＰ１进行３共染，观察是否病毒Ｐ蛋白也被招募至ＳＧ中。结果显示：病毒的ＮＰ蛋白一Ｔ－与ＩＡ１和ＣＢＢＰ１均有定程度的共定位，但Ｐ蛋白与ＳＧ标志物不发生共定位Ｐ蛋ＳＧ过程中发挥一，预示着Ｎ白可能在ＮＤＶ诱导定的作用。１５ ＳＧｍａｒｋｅｒＮＰＤＡＰＩＭｅｒｇｅｚｏｏｍ—ＳＧｍａｒｋｅｒＰＤＡＰｏｏｍＩＭｅｒｇｅｚ■■■■■－３ＮＤＶＮＰ蛋白而非Ｐ蛋白图２，与ＳＧ标志物共定位－Ｆｉ．２２ＴｈｅｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｔｅｒｎｂｅｔｗｅｅｎＮＤＶＮＰｒｏｔ；ｅｉｎｂｕｔｇｐｐ，ｎｏｔＰｒｏ１；ｅｉｎｗｉ化ＳＧｍａｒｋｅｒｓｐ，２．６讨论迄今为止己经有许多病毒被证实通过调控ＳＧ形成来促进自身复制，麻疹病毒（ＭＶ）和仙台病毒（ＳｅＶ）是副黏病毒科的另外两种病毒，这两种病毒在感染细胞后并不诱导细胞产生ＳＧ，原因可能是病毒的Ｃ蛋白抑制了细胞中双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）和ＰＫＲ的激活一，从而抑制ｅＩＦ２ａ的激活和ＳＧ的产生对于另种副黏病毒：呼吸道合胞体病毒（民ＳＶ）来说，病毒感染１化后诱导ＳＧ形成，且抑制持续至感染后２仙。我们的研究结果显示；ＮＤＶ能够诱导稳态ＳＧ形成，不同于ＭＶ和ＳｅＶ，ＮＤＶ和民ＳＶ基因均不编码Ｃ蛋白，我们推测Ｃ蛋白是决定副黏病毒感染后ＳＧ形成的关键因素。需要注意的是ＳＧ只存在于ＮＤＶ感染的细胞中，而且在某些有ＮＰ蛋白表达的细胞中没有检测到ＳＧ，另外，紫外线灭活的ＮＤＶ１６ 不能够诱导ＳＧ的形成，这些结果说明了病毒的复制，而非病毒蛋白本身参与了ＳＧ的形成。病毒的ＮＰ而非Ｐ蛋白位于ＳＧ中，而对于ＲＳＶ的研究结果显示病毒ＮＰ蛋白和Ｐ蛋白标记的合胞体并不与ＳＧ共定位腮腺炎病毒的ＮＰ蛋白包裹ＲＮＡ基因组，水疮性口炎病毒（ＶＳＶ）的Ｎ蛋白似乎能够与不同长度的所有ＲＮＡ成分结合，但是这种结合能够被磯蛋白（ＮＳ）抑制类似的，仙台病°毒Ｐ蛋白能够与未姐装的Ｎ蛋白（Ｎ）形成复合物，这种复合物能Ｐｑ够抑制Ｎ的非法姐装从而有利于核衣壳的组装和病毒转录。在我Ｐ蛋ＳＧ中－们的研巧中，Ｐ蛋白和ＴＩＡ１几乎没有，部分Ｎ白位于而共定位，根据Ｗ上这些报道和我们的结果推测ＮＰ蛋白可能是通过与细胞或病毒ＲＮＡ的结合而被招募至ＳＧ中，剩下的未组装的ＮＰ与Ｐ蛋白形成复合物位于一ＳＧ外，此假说有待实验进步证实。１７ 第三章新城疫病毒通过ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ诱导ＳＧ形成３．１前言ＳＧ主要通过两种机制被诱导，其中经典通路起始于ｅ圧２ａ的磯一－酸化－ＧＴＰｔＲＮＡＭｅｔ复合物（，导致ｅＩＦ２种负责将起始甲硫氨酸装载到４８Ｓ转录起始复合物上的复合物）的减少随后ＲＮＡ结－－合蛋白Ｔ细胞内抗原１１乂１１乂－１相关蛋白评＾和（ＴＩＡＲ）从细胞核Ｗ转运至细胞浆，包裹未翻译的ｍＲＮＡ形成ＳＧ。ｅＩＦ２ａ的５１位磯酸化位点可被多种激酶憐酸化，包括双链ＲＮＡ依赖性激酶（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ总蛋白调节激酶（ｌｌ－ｌ民，ＰＫＲ）、ｅｎｅｒａｃｏｎｔｒｏｎｏｎｄｅｒｅｒｅｓｓ化ｅｇｐｋｉｎａｓｅ－１ａｉ，ＧＣＮ２）、ＰＫＲ样内质网激酶（ＰＫＲ化ｅｅｎｄｏｐｌｓｍｃ－ｒｅｔｕｍｎａｓｅ－ｉｃｕｌｋｉＰＥＲＫ）、亚铁血红素ｅＩＦ２ａ激酶（ｈｅｍｅｒｅｕｌａｔｅｄ，ｇ一－ＨＲＩ）ｅＩＦ２ａｋｉｎａｓｅ。另外种ｅＩＦ２ａ非依赖通路是通过抑制ｅＩＦ４Ｆ，复合物活性诱导ＳＧ形成，包括对其中Ｈ种成分ｅＩＦ４Ａ，ｅＩＦ４Ｇ和ｅＩＦ４Ｅ的抑制，最终导致转录起始效率的降低和ＳＧ形成的减少６１。ＳＧ的诱导途径根据刺激物的不同而不同，本章着重研究参与ＮＤＶ诱导ＳＧ形成过程的具体通路。３．２材料和方法３．２．１病毒和细胞新城疫病毒Ｈｅｒｔｓ／３３毒株由中国兽药监察所提供。将各毒株尿°囊腔接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，在３７Ｃ培养箱中培养，３天（ｄ）后收集尿囊°－７０Ｃ冰箱中液，血凝实验检测病毒滴度分装冻存于。在鸡胚成纤维，４８ｔ３－１ＩＤ５０细胞系（ＤＦ）中进行病毒的ＴＣ半数细胞感染量）的测定。人（宫颈癌细胞系（ＨｅＬａ）购自中科院细胞库。３．２．２抗体和试剂１１１１１１１１１－嚷吟霉素和鼠嘿吟霉素单克隆抗体（０８６０１０〇１〇１１３１３１１６ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ１２Ｄ１０，ＭＡＢＥ３４３）购自美国ＭｅｒｃｋＭｉｌ邮ｏｒｅ公司，鼠－－ａｃ－ｔｉｎ单克隆抗体（Ｍｏｕｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉａｃｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｐｐｙ，Ａ－ｔ１９７８）购自美国Ｓｉｍａ公ＴＩＡ１ｏａｇ司；羊多克隆抗体（ｇ１８ －－－ｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉＴＩＡ１，ｓｃ１７５１），兔抗ｅＩＦ２ａ多克隆抗体（民ａｂｂｉｔｐｏ－－ｐｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｅＩＦ２ａ，ｓｃ１１３８６），兔抗ＰＫＲ多克隆抗体（Ｒａｂｂｉｔｌｃｌｏｎａｎｔｉ－ＰＫＲ－ｏｌａ，ＳＣ７０７）ａｎｔａｃｒｕｚｅ公司ｐｙ购自美国Ｓ；兔抗磯酸ｌ－－化ｅＩＦ２ｔ（Ｓｅｒ５１）多克隆抗体（ＲａｂｂｉｔｐｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｅＩＦ２ａ，ｙｐ９７２１Ｓ）购自美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；兔無憐酸化ＰＫＲ－－多克隆抗体（ＲａｂｂｉｔｏｌｃｌｏｎａｌａｎｔｉＰＫＲ，Ｔ４４６购自美国ｐｙｐｐ）Ｅｉｔｏｍｉｃｓ公司３ＢＰ１ｌａｎｔｉ－ｐ；鼠Ｇ单克隆抗体（ｍｏｕｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａＧ３ＢＰｌａｂ％５７４）购自美国Ａｂｅａｍ公司；鼠ｄｓＲＮＡ多单克隆抗体，Ｍｏｕｓｅ－（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｄｓＲＮＡａｎｔｉｂｏｄｙ口，１００１０２００）购自匈牙利Ｓｃｉｃｏｎｓ公司；ＤＡＰＩ购自碧云天生物技术有限公司；小鼠抗核蛋白（ＮＰ）磯蛋白（Ｐ）单克隆抗体由本实验室制备。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记羊抗鼠ＩｇＧ购自美国ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ公司。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染试剂，红色及绿色焚光二抗购自美国ｌｉｆｅ公司。３．２．３质粒和干扰ＲＮＡ编码巧ａｇ标签的野生型（ＷＴ）ｅＩＦ２ａ，Ｓ５１Ａ和Ｓ５１Ｄ突变ｅＩＦ２ａ＇ＲＮＡＰＫＲ－由本实验室构建。针对ＰＫＲ的時异性干扰（ｓｉ：５＇ＧＣＧＡＧＡＡＡＣＵＡＧＡＣＡＡＡＧＵ－３ＲＮＡ由上）和无序海吉玛公司合成。３．么４免疫巧光３．２．４．１免疫焚光检测突变ｅＩＦ２ａ对ＮＤＶ诱导ＳＧ的影响５１）将ＨｅＬａ细胞＾１０个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中（培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在ｒｒＣ、５％Ｃ〇２细胞培养箱中培养至７０％，Ｗｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染试剂将ＷＴ，Ｓ５１Ａ和Ｓ５１ＤｅＩＦ２ａ质粒分别转染至ＨｅＬａ细胞中。２）转染２４ｈ后，Ｗ无血清培养基洗緣细胞３次，加入无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅｒｔｓ／３３毒株ＩｍＬ，病毒感染量为１ＭＯＩ（多重感染复数），３７Ｃ吸附Ｉｈ后，去掉病毒液，无血清培养基洗緣细胞３次，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７Ｔ：、５％Ｃ〇２细胞培养箱中继续培养。同时设畳阴性和阳性对照组细胞，阴性组除不感一致染ＮＤＶ外，其它处理方式与病毒感染组。１９ ３）ＮＤＶ病毒感染１化后，去掉培养基，ＰＢＳ洗涂细胞２次，加入４％中性甲醇室温固定２０ｍｉｎ，再ＷＰＢＳ洗涂细胞３次。４）在湿润的滤纸上放置保鲜膜，在保鲜膜上滴加１００阵１：１０００ＩＡ－１ＴＢＳ稀释的Ｔ多克隆抗体，再放上含有细胞的飞片，保证抗体°与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ解育化后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。５）在保鲜膜上滴加１００阵１：２００ＴＢＳ稀释的驴抗羊焚光二抗，再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。避光艇育Ｉｈ后，取出飞片，ＴＢＳ洗緣３遍。６）重复步骤３－４，对第二种抗体进行染色（Ｆ１巧）７）在载玻片上滴加封片剂，然后放上含有细胞的飞片，用激光共聚焦显微镜观察、摄片。３－．２．４．２免疫焚光检１ＮＤＶ感染后ｄＲＮＡ／ＰＫＲ与ＴＩＡ１１ｓ共定位５１）将ＨｅＬａ细胞５ｘｌ〇个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中（培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７尤、５％０）２细胞培养箱中培养至７０％，２化后，Ｗ无血清培养基洗緣细胞３次，加入Ｗ无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅｒｔｓ／巧毒株°ＩｍＬ，病毒感染量为１ＭＯＩ（多重感染复数），３７Ｃ吸附Ｉｈ后，去掉病毒液，无血清培养基洗缘细胞３次，加入含１０％ＦＢＳ的°ＤＭＥＭ培养基在３７Ｃ、５％Ｃ０２细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性和阳性对照组细胞，其它处理方式，阴性组除不感染ＮＤＶ外与病毒感染组一致。２）ＮＤＶ病毒感染１２ｈ后，去掉培养基，ＰＢＳ洗涂细胞２次，加入４％中性甲酵室温固定２０ｍｉｎ，再ＷＰＢＳ洗緣细胞３次。３）在湿润的滤纸上放置保鲜膜１００＾１：１０００，在保鲜膜上滴加叫ＴＢＳ稀释的Ｔ－ＩＡ１多克隆抗体，再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７ｔ赔育Ｉｈ后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。４）在保鲜膜上滴加１００阵１：２００ＴＢＳ稀释的驴抗羊茨光二抗，°再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ避光膊育Ｉｈ后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。５－４二ｄＡ或ＰＫＲ）重复步骤３，对第种抗体进行染色（ｓＲＮ）６）在载玻片上滴加封片剂，然后放上含有细胞的飞片，用激光２０ 共聚焦显微镜观察、摄片。３．２．４．Ｓ免疫焚光检测ＰＫＲ干扰后ＳＧ的形成状态５１）将ＨｅＬａ细胞＾１０个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中（培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基°在３７Ｃ、５％Ｃ０２细胞培养箱中培养至７０％，Ｗｌｉｐ〇ｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染试剂将ｓｉＰＫＲ转染至ＨｅＬａ细胞中。２）转染４化后，［＾无血清培养基洗涂细胞３次，加入无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅｒｔｓ／３３毒株ＩｍＬ，病毒感染量为１ＭＯＩ（多重°感染复数），３７Ｃ吸附比后，去掉病毒液无血清培养基洗緣细°胞３次，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在巧Ｃ、５％Ｃ０２细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性和阳性对照组细胞，阴性组除不感？染ＮＤＶ外一，其它处理方式与病毒感染组致。３）ＮＤＶ病毒感染１２ｈ后，去掉培养基，ＰＢＳ洗涂细胞２次，加入３４％中性甲酸室温固定２０ｍｉｎ，再ＰＢＳ洗絡细胞３次。４）在湿润的滤纸上放置保鲜膜，在保鲜膜上滴加ＩＯＯｍＬ１：１０００ＴＢＳ稀释的Ｔ－ＩＡ１多克隆抗体，再放上含有细胞的飞片，保证抗体°与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ僻育Ｉｈ后，取出飞片，ＴＢＳ洗緣３遍。５）在保鲜膜上滴加ＩＯＯｍＬ１：２００ＴＢＳ稀释的驴抗羊焚光二抗，°再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ避光勝育比后，取出飞片，ＴＢＳ洗緣３遍。６３－４二）重复步骤，对第种抗体进行染色（Ｇ３ＢＰ１）７）在载玻片上滴加封片剂，然后放上含有细胞的飞片，用激光共聚焦显微镜观察、摄片，并对视野中有ＳＧ的细胞进行计数。３．２．５ＳＧ点的计数通过对１０个随机的２００倍放大的视野进行ＳＧ计数判定ＳＧ形。视野中的细胞数通过细胞核计数完成成状态，ＳＧ形成细胞通过ＴＡ－１Ｉ或Ｇ化Ｐ１计数完成。ｅｒｎ－．２３．６Ｗｅｓｔｂｌｏｔ３－．２．６．１Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ检测ＮＤＶ感染后ｅＩＦ２ｔ磯酸化和总蛋白翻译水平２１ ５ｘ１）将ＨｅＬａ细胞５ｌ〇个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中，用含°１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在巧Ｃ、５％£化细胞培养箱中培养至７０％，去掉培养基，Ｗ无血清培养基洗緣细胞３次，加入无血清°培养基稀释的ＮＤＶＨｅ化／３３毒株ＩｍＬ，病毒感染量为１ＭＯＩ，３７Ｃ吸附Ｉｈ后，去掉病毒液，无血清培养基洗涂细胞３次，加入含°１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７Ｃ、５％Ｃ〇２细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性对照组细胞；阴性组除不感染ＮＤＶ外，其它处理方式与病毒感染组一致。２）病毒感染后４ｈ、８ｈ、１２ｈ、１化、２化和２４ｈ收取细胞样品。°１，到达指定时间点前＾１］＼４嚷吟霉素处理化处理之后用４０预冷的＾°ＰＢＳ洗涂细胞２次，在冰上用细胞刮或细胞护刮取细胞，４Ｃ°４０００ｒ／ｎｉｉｎ离也５ｍｉｎ，去上清，再用ＰＢＳ重悬，４Ｃ４０００ｒ／ｍｉｎ离瓜°５ｍ－ｉｎ，去上清，细胞沉淀冻存于７０Ｃ冰箱。３）在细胞沉淀中加入１２０阵Ｗｅｓｔｅｒｎ及ＩＰ细胞裂解液，再用细°胞超声仪破碎细胞Ｉｓ，４Ｃ１２０００ｒ／ｍｉｎ离也５ｍｉｎ，取上清，用增强型ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，在加入３０＿ｉＬ５Ｘ上样缓｜冲液，煮沸５ｍｉｎ，室温２０００ｒ／ｍｉｎ离也５ｍｉｎ。４）ＳＤＳ－ＰＡ畑凝胶电泳：每孔中蛋白上样量为４０帖，先调节电压至恒压８０Ｖ，待蛋白样品从层积胶进入分离胶后，调整电压为１００Ｖ，继续电泳至漠酪蓝迁移至分离胶底部。５－）蛋白转印；ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结束后，从玻璃板中将凝胶取出，与Ｈ层滤纸、海绵和根据凝胶大小剪好的硝酸纤维素（ＮＣ）膜＂＂一起浸泡于预冷的转印缓冲液中的顺序安装电，按照膜正胶负－海绵－Ｈ层滤纸－－ＮＣ膜－Ｈ层滤纸－－正极泳装置，及负极凝胶海绵。加入电泳缓冲液后在冰浴条件下进行转印，转印条件为恒流２５０ｍＡ１．化。６）转印完成后，Ｗ５％（Ｖ／Ｗ）脱脂季Ｌ室温封闭２ｈ，去除封闭°液，加入１：１０００含１％叠氮钢的ＴＢＳＴ稀释抗体，４Ｃ作用过夜，然一Ｏｍ抗进行回收ｉｎ。加入１：８０００后将，ＷＴＢＳＴ洗緣３次，每次ｌ－ＨＲＰ二抗ＴＢＳＴ稀释的羊抗贏或羊抗兔ＩｇＧ，室温作用Ｉｈ，ＷＴＢＳＴ洗涂３次ｉｎ。，每次ｌＯｍ８）使用ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌｗｅｓｔｉｃｏＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅｓ试齐Ｕ盒ｐ＇在暗室中进行显色。将ＥＣＬ显色试剂盒的Ａ液和Ｂ液１：１混合后与２２ －５ｍＮＣ膜解育，作用ｌｉｎ后，将ＮＣ膜放置于暗盒内曝光，将曝光的胶片先在显影液中显示目的条带，自来水冲洗，最后放置于定影液中定影。９）ＮＣ膜的Ｒｅ－ｂｒｎｌｏｔｉｎｇ：完成Ｗｅｓｔｅ发光检测后，将膜在蒸傭一ｍｉｎ二ｉｎ，水中漂洗５ｍ，加入抗抗去除液腰育５再加入足量蒸馈水漂洗５ｍｉｎ，后进行上述封闭和抗体作用等步骤。Ｓ－．２．６．２Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ检额ｓｉＰＫＲＰＫＲ和ｅＩＦ２ａ！１后磯酸化水平５１）将ＨｅＬａ细胞５ｘｌ〇个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中，用含°１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７Ｃ、５％０）２细胞培养箱中培养至〇７０／〇，ｌｉｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染Ｓ巧ＫＲ。ｐ２）转染４化后去掉培养基，无血清培养基洗涂细胞３次，加入Ｗ无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅ化／巧毒株ＩｍＬ，病毒感染量为１°ＭＯＩ，３７Ｃ吸附化后，去掉病毒液，Ｗ无血清培养基洗涂细胞３°次，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７Ｃ、５％０）２细胞培养箱中维续培养。同时设置阴性对照组细胞，阴性组除不感染ＮＤＶ外，一致其它处理方式与病毒感染组。°２）病毒感染１化收取细胞样品，处理之后用４Ｃ预冷的ＰＢＳ洗°緣细胞２次，在冰上用细胞刮或细胞护刮取细胞，４Ｃ４０００ｒ／ｍｉｎ离°、也５ｍｉｎ，去上清，再用ＰＢＳ重悬，４Ｃ４０００ｒ／ｍｉｎ离也５ｍｉｎ上，去°清－７０，细胞沉淀冻存于Ｃ冰箱。３）下步骤同３．２．６．１３．３ＮＤＶ感染诱导ｅｌＦ２ａ權酸化和总蛋白翻译水平下降ｓｓＰＫＲ和ｔｉｅＩＦ２ａ是经典的诱导ＳＧ形成的通路，因此我们研究了ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路是否在ＮＤＶ感染诱导ＳＧ中必须。结果表明：ＮＤＶ感染后期能够诱导强烈诱导ｅＩＦ２ａ稱酸化（图３－１），这与病毒一感染诱导的ＳＧ时间点致－ＧＴＰ－ｔＲＮＡＭｅｔ。ｅＩＦ２ａ麟酸化导致ｅＩＦ２Ｗ四聚体复合物量的减少，从而导致细胞总蛋白翻译量降低。因此一接下来我们用种非放射性标记方法：ＳＵｎＳＥＴ，来检测ＮＤＶ感染后不同时间点磁蛋白合成情况。结果显示：ＮＤＶ感染后导致宿主蛋白翻译量的逐渐降低，相应的，病毒ＮＰ蛋白随着病毒感染过程逐２３ 渐增加－。需要注意的是，感染后２４ｈｅＩＦ２ａ和３ａｃｔｉｎ的量的降低是！由于病毒感染后细胞脱落导致的（图３－２）。￣￣￣￣Ｍｏｃｋ４８１２而２０２４ｈ！ｐ義＃？ＰｕｒｏｍｃｉｎＪＨ＇ｙ愈ｍｉ？’Ｄｉｎｉ’ｕｕｕｕｌＵｗｍｉｇｉ＾ｇｇｇｇｌｇｇｌｉ＞ｍｍｍ？ｍｍｍｍｍｍＰａｃｔｌｎｉｍｍ－＇．＇－ｅｌＦ２ａｍｍｐＭｌ窜ｅｌＦ２ａ嗎ＩＰ誦擊ｉＷｉ賴Ｉ除禱賺－图３１ＮＤＶ感染诱导ｅＩＦ２ａ的磯酸化及总蛋白翻译减少－Ｆｉ．３１ＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｌｅａｄｓ化ｔｈｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆｇｅＩＦ２ａａｎｄｐｐｙｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｇｌｏｂａｌｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｐ３＾４ｅＩＦ２ａ５１位磯酸化参与了ＮＤＶ诱导ＳＧ的过程为了进一步研究Ｆ２ａ在ＮＤＶ诱ｅＩ导ＳＧ中的作用，我们转染了两种ｅＩＦ２ａ磯酸化位点突变引物：Ｓ５１Ｄ和Ｓ５１ＡｅＩＦ２ａ，分别模拟ｅＩＦ２ａ的过磯酸化和去憐酸化形式。转染ＨｅＬａ细胞后结果显示，野生型ｅＩＦ２ａ转染的细胞中ＳＧ形成没有变化，而Ｓ５１ＡｅＩＦ２ａ质粒转染的细胞中没有ＳＧ形成，周围细胞中ＳＧ形成并未受到影响，Ｓ５１ＤｅＩＦ２ａ转染的细胞中形成ＳＧ，值得注意的是在转染细胞中形成的ＳＧ点似乎比正常状态下病毒感染诱导的ＳＧ点形态上更大，数－２）量上更少（图３。２４ ？－？．？？＊－．ＴｌａＤＡＰＭｅｒｅＩＡ１ＦｇＩｇ■ＩＨＨｂ■—■■图３－２ｅＩＦ２ａ憐酸化对于ＮＤＶ诱导ＳＧ至关重要Ｆ－ｔｉｇ．３２ｅＩＦ２ａｈｏｓｈｏｒｌａｉｏｎａｔＳ５１ｉｓｎｅｃｅｓａｒｒｆｏｒ出ｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｐｙｙ－ｏｆＮＤＶｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓ３．５ＮＤＶ感染后病毒ｄｓＲＮＡ和ＰＫＲ均位于ＳＧ中ＮＤＶ属于单股负链ＲＮＡ病毒，感染过程中能够短智的产生ｄｓＲＮＡ中间体，能够激活ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路和ＳＧ形成。鉴于此我们检测了病毒感染的细胞中ｄｓＲＮＡ和ＰＫＲ的产生状况及亚细胞定位，结果显示：病毒感染后细胞中ｄｓＲＮＡ和ＰＫＲ均与ＳＧ标志蛋白ＴＩＡ－１有明显的共定位现象，说明ＮＤＶ感染产生的ｄｓＲＮＡ极有可／ｅＩＦ２ａ通－３能通过激活ＰＫＲ路诱导ＳＧ的形成（图３）。２５ －ＴｌＡ１ｄｓＲＮＡＤＡＰＩＭｅｒｇｅＭＷ———－ＴｉＡ１ＰＫＲＤＡＰＩＭｅｒｇｅ■■■■图３－３ＮＤＶ感染后病毒ｄｓＲＮＡ和ＰＫＲ与Ｔ－ｌＩＡ共定位＂－ｗｅｅ凸－Ｆｉ．３３ＴｈｅｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｔｔｅｒｎｂｅｔｄｓＲＮＡ／ＰＫＲｗ她！＾＾ｇｐ１ｉ－ｉｎｆｎＮＤＶｅｃｔ；ｅｄｃｅｌｌｓ义６ＰＫＲ参与了ＮＤＶ感染诱导的ｅＩＦ２ａ激活上述结果证实了一ＮＤＶ感染能够诱导ｄｓＲＮＡ的产生，下步我们观察了ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ是否在ＮＤＶ感染过程中被激活，我们ＷＩｍＭ亚神酸纳（ＡＲＳ）刺激３０ｍｉｎ作为阳性对照，我们发现ＡＲＳ刺激后ＰＫＲ和ｅＩＦ２ａ被显著磯酸化，同时ＮＤＶ感染组的ＰＫＲ和ｅＩＦ２ａ也－４Ａ）被磯酸化（图３，而干扰ＰＫＲ之后感染ＮＤＶ，结果显示ｅＩＦ２ａ－４Ｂ）磯酸化水平明显下调（图３。这些结果说明在ＮＤＶ感染过程中，ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ被激活，且ＰＫＲ的激活对下游ｅＩＦ２ａ的磯酸化至关重要。２６ ＡＭｏｃｋＡＲＳＮＤＶＢＳｃｒａｍｂｌｅｓｉＰＫＲ’－一一一＞－ＰＫＲＰＫＲｒ，；；＾’■＾？＊＊＊－ｅ＞ｌＦ２ａ＂ｉｉ—ｉ＂＊ＰＫＲ９ｉｍｔｍｍｐ■＾－－ｒｎｍｍｒｎｅｌＦ２ａｉｉｐｅｌＦ２ａｍｍｍｍ１ｎｐｉｐｗｉｐｉｐｔ齡诏：；心黨献戚－）啤＇马站Ｎ聲考爷占！考自？雜麵麵－ｅｗｍ齡翁幽＞ｕｍ議ｗａｃｔｉｎｌＦ２ａ儀Ｐ＾昨譽ｃ＂ｎＪＭ：ＩＩ图３－４ＮＤＶ感染激活ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路（Ａ）ＮＤＶ感染诱导ＰＫＲ和ｅＩＦ２ａ磯酸化激活；（Ｂ）干扰ＰＫＲ＇抑制下游ｅＩＦ２ａ的磯酸化－ｖａＦｉ．３４ＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｌｅａｄｓ化化ｅａｃｔｉｔｉｏｎｏｆＰＫＲ／ｅＩＦ２ａｇａｔｈｗａｐｙＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｌｅａｄｓ；ｔ：ｈｈｏｈｏｒｌｔｉＡ１ｏｅｓａｏｎｏｆＰＫＲａｎｄｅＩＦ２ａ（）ｐｐｙ；ＢＤｅｌｅｔｉｏｎｏｆＰＫＲｉｎｈ化ｉｔｔｉｉｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆｅＩＦ２ａ（）ｐｐｐｙ３．７ＰＫＲ干扰导致ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ点的减少上述结果显示ＮＤＶ感染能够通过产生ｄｓＲＮＡ激活ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路，ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路的激活是否与ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ有关，我们对内源性ＰＫＲ干扰后感染ＮＤＶ病毒－１，对ＳＧ两种标志物ＴＩＡ和Ｇ３ＢＰ１进行共染色，发现与转染无序ＲＮＡ的对照组相比，干扰ＰＫＲ组中有ＳＧ点状聚集的细胞显著减少（图３－５Ａ）。对视野中有ＳＧ的细胞进行计数，发现干扰ＰＫＲ组中有ＳＧ的细胞仅为对照组０％（３－５Ｂ）的约３图，说明干扰ＰＫＲ通过影响ｅＩＦ２ａ磯酸化影响了ＮＤＶ感染诱导ＳＧ的形成。２７ ？＊ｓｏＡＢ＊Ｔ－１Ｇ３ＢＰ１ＭｅｒｅＩＡｇ＂＂■ｎ＾Ｈ＾Ｓ圓圓３０－＾１２０－ｊ－１０＾１ｔｌＩＨ＾ＨＢＢＩ〇＿Ｌ＾—Ｓｃｕｍｂｌｅｓ巧ＫＲ图３－５干扰ＰＫＲ抑制ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ形成（Ａ）ｓｉＰＫＲ抑制ＮＤＹ感染诱导的ＳＧ（Ｂ）ＳＧ点的计数ｉ－－Ｆｇ．３５ＤｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆＰＫＲｉｎｈｉｂｉｔＮＤＶｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓ－ｕａｎｔＡｓ巧ＫＲｉｎｈｉｂｉｔＮＤＶｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓＢｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＧｄｏｔｓ（）（）Ｑ３．８讨论副黏病毒科病毒猿肾病毒５型（ＳＶ５）感染宿主细胞不激活ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路，因此不能抑制细胞总蛋白的翻译相应的，ＳＶ５感染诱导的病毒胞质小体就不与ＳＧ标志性成分共定位。我们的前期研究证实ＮＤＶ感染能够通过激活ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路诱导干扰ｓｔｗａ通素水平的上调。在此项研究中我们证实了ＰＫＲ／ｅＩＦ２路在ＮＤＶ一感染诱导的ＳＧ中发挥关键的作用。另外个ｅＩＦ２ａ非依赖途径涉及ｓｔＷｅｓＩＦ４Ｆ复合物的失活。但是，在ＮＤＶ感染过程中ｅＩＦ４Ｆ的两个主要成分ｅｕＵ－ＩＦ４Ｇ和細４Ｅ均发生明显磯酸化，并且用ｍ７ＧＴＴｐｄｏｗｎ实验，我们观察到ＮＤＶ感染在ＨｅＬａ细胞中增强了ｅＩＦ４Ｆ复合物的装配（未发表数据）。这些结果说明了ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ形成依赖于ｅＩＦ２ａ的磯酸化，而非通过抑制ｅＩＦ４Ｆ活性的方式。需要注意的是，ＰＫＲ的干扰并未完全阻断ＳＧ的形成，除了有干扰效率一２ａ的磯酸方面原因外，还有可能其他Ｈ种激酶也参与了ｅＩＦ化和ＳＧ的形成。２８ 第四章新城疫病毒感染诱导的ＳＧ为经典型ＳＧ４．１前言和其他理化刺激相比一，病毒作为种生物性刺激源诱导ＳＧ有一ＳＧ一个动态过程其特殊性，方面病毒诱导形成是，病毒感染不同阶段对ＳＧ的调控左右可能不尽相同，例如小ＲＮＡ病毒感染早期能够观察到细胞中存在ＳＧ，但后期由于病毒的３Ｃ蛋白切割Ｇ３ＢＰ１Ｐ＆一ＡＷ蛋白致使ＳＧ消失。另方面，由于病毒的多样性，不同病毒诱导或抑制ＳＧ的方式也不同，例如野生型流感病毒感染细胞不诱导ＳＧ产生，但ＮＳ１突变的病毒却能通过ＰＫＲ依赖途径诱导ＳＧ．ＳＧ形成的形成而本文中的ＮＤＶ巧能稳定诱导。由于这些病毒感染诱导ＳＧ的特殊性，致使病毒诱导的ＳＧ类型也有一定程度的多样性，例如有些病毒诱导产生抗病毒颗粒（ＡＶＧ）抑制病毒増殖，而与其他理化刺激诱导的ＳＧ不同，ＡＶＧ６２６３ｔ在蛋白翻译抑制药物放线菌酬的处理下并不发生降解＾３，另外，＂＂一些ＳＧ标志病毒感染诱导的假ＳＧ不含有，例如ｅ圧３或ｅＩＦ４Ａ等，。而ＳＧ的类型与其在ＳＧ复制过程中发挥的作用息息相关因此本章研究了ＮＤＶ感染的ＳＧ是否与ＡＲＳ刺激诱导的ＳＧ同样为经典型ＳＧ。和４．２材科和方法－４．２．１病毒巧Ｉ细賄新城疫病毒Ｈｅｒｔｓ／３３毒株由中国兽药监察所提供。将各毒株尿°囊腔接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，在巧Ｃ培养箱中培养，３天的）后收集尿囊°血凝实验检测病毒滴度－７０Ｃ冰箱中液分装冻存于。在鸡胚成纤维，，ｔｗ－细胞系（ＤＦ１中进行病奉的ＴＣＩＤ５０半数细胞感染量）的测定。人）（宫颈癌细胞系（ＨｅＬａ）购自中科院细胞库。４．２．２抗体和试剂－ａｃｔ放线菌巧（ＣＨＸ）（Ｃ７６９８），鼠ｉｎ单克隆抗体（Ｍｏｕｓｅｐｍｏｎｏｃ－－ｎｌｏｎａｌａｎｔｉａｃｔｉａｎｔｉｂｏｄ，Ａ１９７８）购自美国Ｓｉｍａ公司ｐｙｇ；羊２９ －－－ＴＩＡ１（ｏａｔｏｃａａｎｔ－Ｃ多克隆抗体ｇｐｌｙｌｏｎｌｉＴＩＡ１，Ｓ１７５１）购自美国Ｓａｎｔａｃｍｚｅ司－公；兔抗ｒＰＳ６卓克隆抗体（Ｒａｂｂｉｔｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉ－－ｉＰＳＧ，ＳＣ２２１７），兔抗ｅＩＦ３Ａ多克隆抗体（Ｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａ打ｔｉ－ｎａｅＩＦ３Ａ，ＳＣ２５３８）购自美国ＣｅｌｌＳｉｌｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏ公司；兔抗ｇｇｇｙｅＦ４Ｅａｂｂｉｌｌｏｌａｎｔ－Ｉ多克隆抗体（ｒｔｐｏｃｎａｉｅＩＦ４Ｅ，ａｂ１１２６），兔抗ｙｅＩＦ４Ｇ克隆抗体（ｒａｂｂｌｌｌａｔｉ－多ｉｔｏｃｏｎａｎｅＩＦ４Ｇ，ａｂ４７６４９）购自美ｐｙ国Ａｂｅａｍ公司；ＤＡＰＩ购自碧云天生物技术有限公司；小鼠抗核蛋白（ＮＰ）单克隆抗体由本实验室制备。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记羊抗鼠ＩｇＧ购自美国ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ民ｅｓｅａｒｃｈ公司。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染试剂，红色及绿色英光二抗购自美国ｌｉｆｅ公司。４．２．３药物试验５ｘ１）将ＨｅＬａ细胞５ｌ〇个接种至３５ｍｉｎ细胞培养皿中（培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在°３７Ｃ、５％Ｃ０２细胞培养箱中培养至７０％，２４ｈ后无血清培养基洗涂细胞３次，加入无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅｒｔｓ／３３毒株ＩｍＬ，°病毒感染量为１Ｍ０Ｉ（多重感染复数），３７Ｃ吸附Ｉｈ后，去掉病毒液，Ｗ无血清培养基洗涂细胞３次，加入含ｌＯＯ／ｍＬＣＨＸ，ｎｇ°１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７Ｃ、５％Ｃ０２细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性和阳性对照组细胞，阴性组除不感染ＮＤＶ外，其它处理方式与病毒感染组一致，阳性组为ＩｍＭＡＲＳ处理化后收养，药物处理全程加入ＣＨＸ。２）ＮＤＶ病毒感染１２ｈ后，去掉培养基，ＰＢＳ洗涂细胞２次，加入４％中性甲酸室温固定２０ｍｉｎ，再ＰＢＳ洗壤细胞３次。３）在湿润的滤纸上放置保鮮膜，在保鲜膜上滴加１００ｉＬ１：１０００｜ＴＢＳ稀释的Ｔ－ＩＡ１多克隆抗体，再放上含有细胞的飞片，保证抗体°与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ艇育化后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。４）在保鲜膜上滴加１００阵１：２００ＴＢＳ稀释的驴抗羊焚光二抗，°再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ避光膊育化后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。５）重复３－４步骤，对第二种抗体进行染色（ＮＰ）６）在载玻片上滴加封片剂，然后放上含有细胞的飞片，用激光３０ 共聚焦显微镜观察、摄片。４．２．４免疫巧光检测ＳＧ与特异性标志共定位５１）将ＨｅＬａ细胞５ｘｌ〇个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中（培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基°在３７（：、５％〇）２细胞培养箱中培养至７０％，２４１１后，［＾无血清培养基洗涂细胞３次，加入Ｗ无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅｒｔｓ／３３毒株ＩｍＬ，病毒感染量为１Ｍ０Ｉ（多重感染复数），３７ｔ吸附Ｉｈ后，去掉病毒液，无血清培养基洗缘细胞３次，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７足、５％（：化细胞培养箱中继续培养。同时设置’其阴性和阳性对照组细胞，阴性组除不感染ＮＤＶ外，它处理方式与病毒感染组一致。２）ＮＤＶ病３、６、９、１２、２４ｈ后，去掉培养基ＰＢＳ洗毒感染，涂细胞２次ｉｎ，再ｉ＾ＰＢＳ洗緣细胞，加入４％中性甲酵室温固定２０ｍ３次。３）在湿涧的滤纸上放置保鲜膜，在保鲜膜上滴加１００阵１：１０００ＴＢＳ稀ＴＩＡ－释的１多克隆抗体，再放上含有细胞的飞片，保证抗体°与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ腾育比后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。４）在保鲜膜上滴加１００咕１：２００ＴＢＳ稀释的驴抗羊茨光二抗，°再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ避光膊育化后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。５３－４）重复步骤，对第二种抗体进行染色（ｒＰ％，ｅＩＦ４Ｅ，ｅＩＦ４Ｇ，ｅＩＦ３Ａ）。６）在载玻片上滴加封片剂，然后放上含有细胞的飞片，用激光巧聚焦显微镜观察、摄片。４．３ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ可被放线菌巧降解ＳＧ中ｍＲＮＡ的存在是动态的过程，ＳＧ形成过程中ｍＲＮＡ在ＳＧ和多核糖体之间穿梭，而放线菌雨能够稳定多核糖体，使多核糖体中的ｍＲＮＡ不能被释放出来，从而抑制ＳＧ形成。但不同于经典ＳＧ，抗病毒颗粒在放线菌爾处理后不发生降解。为了检测ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ为何种类型ＳＧ，我们用ＣＨＸ处理ＨｅＬａ细胞后感染３１ ＮＤＶ，结果显示：ＣＨＸ处理之后细胞中的ＳＧ发生完全降解，而对照组细胞照常产生ＳＧ。阳性对照ＡＲＳ诱导产生的ＳＧ同样也被ＣＨＸ降解（图４－１）。ＣＨＸ－ＣＨＸ＋（）（）Ｔ－－ＩＡ１ＮＰＤＡＰｅｒｅ１ＩＭｇＴＩＡＮＰＤＡＰＭｅｒＩｇｅ■■■■■■■■国■圓■■■Ｑ巧■田图４－１ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ被ＣＨＸ降解－－Ｆｉ．４１ＮＤＶｉｎｄｕｃｅｄＳＧｓｗｅｒｅｄｅｒａｄｅｄｂｙＣＨＸｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｇ４．４ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ与小核糖体亚基共定位经典ＳＧ形成过程中，ｍＲＮＡ和结合的翻译起始复合物等４０Ｓ位于ＳＧ中，但由于ＳＧ中没有６０Ｓ大核糖体因此不能够发挥翻译功能，而Ｅ３蛋白突变的牛痘病毒感染细胞诱导的抗病毒颗粒中没有经典ＳＧ中包含的４０Ｓ小核糖体亚基，同时也能抵抗ＣＨＸ的降解作用ｔＷ一，为了进步确定ＮＤＶ感染形成ＳＧ的类型，我们对ＳＧ标志物ＴＩＡ－１Ｓ６和小核糖体亚基巧进行共染色，观察是否有共定位，结果显示：在对照细胞中，巧Ｓ６均匀分布在细胞质中，而阳性对照ＡＲＳ刺激的细胞中巧％与ＴＩＡ－１共定位ＳＧ，类似的，病毒感染诱导的中巧％与病毒感染的ＳＧ明显共定位４－２）。（图３２ ’－ＰＳ６ＤＡＲＴＩＡ１ｒＩＭｅｒｇｅｍｓｍｉＰＨＤ、，．，■Ｉ巧？图４－２ＮＤＶ感染的ＨｅＬａ细胞中ＳＧ标志物ＴＩＡ－１与ｒＰＳ６共定位－－－ｒｋｅｒＦｉ．４２ＳＧｍａＴＩＡ１ｉｓｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄｗｉｔｈ１Ｐ１Ｓ６ｉｎＮＤＶｇｉｎｆｅｃｔｅｄＨｅＬａｃｅｌｌｓ４．５ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ与翻译起始因子共定位’－－正常未应激状态下，ｅＩＦ２ＧＴＰｔＲＮＡＭｅｔ与转录本的５帽子结ｔ构结合形成４８Ｓ复合物，通过反密码子与ＲＮＡＭｅｔ结合之后，ｅＩＦ５促进了ＧＴＰ水解，初期的起始因子被６０Ｓ亚基替换。ｅＩＦ２ａ的磯酸ｅＩＦ２－－ｔｔ－化使ＧＴＰＲＮＡＭｅ减少，细胞核中的ＴＩＡ１转移至细胞质－中，与非经典的ｅＩＦ２ｅＩＦ５缺失的翻译前体复合物结合，通过ＴＩＡ１的自聚合区域聚集形成ＳＧ，。因此在经典ＳＧ中应该含有除了ｅＩＦ２和ｅＩＦ５之外的其他翻译起始因子，例如ｅＩＦ３、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ等。我们在ＮＤＶ感染的细胞中对レッ上蛋白和ＳＧ标志物进行共染色，结果显示一，Ｗ上Ｈ种翻译起始因子均与病毒感染诱导的ＳＧ有定程度－３－－的共定位（图４、４４、４５）。３３ Ｔ－ｅＩＡ１ｅｌＦ４ＥＤＡＰＩＭｅｒｇｍｍａｍ－３－图４ＮＤＶ感染的ＨｅＬａ细胞中ＳＧ标志物ＴＩＡｌ与ｅＩＦ４Ｅ共定位－－－Ｆｉｇ．４３ＳＧｍａｒｋｅｒＴＩＡ１ｉｓｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄｗ地ｅＩＦ４ＥｉｎＮＤＶｉｎｆｅｃｔ；ｅｄＨｅＬａｃｅｌｌｓ－ｅＴＩＡ１ｌＦ３ＡＤＡＰＩＭｅｒｇｅｍｍｍｍ３４ －－４图４ＮＤＶ感染的ＨｅＬａ细胞中ＳＧ标志物ＴＩＡ１与ｅＩＦ３Ａ共定位Ｆ－－－ｉ．４４ＳＧｍａｒｋｅｒＴＩＡ１ｉｓｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄｗｉ化ｅＩＦ３ＡｉｎＮＤＶｇｉｎｆｅｃｔｅｄＨｅＬａｃｅｌｌｓＴ－ｒＩＡ１ｅｌＦ４ＧＤＡＰＩＭｅｇｅＨＨＢＨ国■■■！－４－图４ＮＤＶ感染的ＨｅＬａ细胞中ＳＧ标志物ＴＩＡ１与ｅＩＦ４Ｇ共定位－－ｚｅｄｗ－Ｆｉ．４４ＳＧｍａｒｋｅｒＴＩＡ１ｉｓｃｏｌｏｃａｌｉｉ也ｅＩＦ４ＧｉｎＮＤＶｇｉｎｆｅｃｔｅｄＨｅＬａｃｅｌｌｓ４．６讨论病毒感染诱导的细胞质颗粒与经典ＳＧ在组成和功能上均有可能不同，上述提到Ｅ３蛋白突变的牛痘病毒诱导的ＡＶＧ不含４０ｓ成ｔＷＳＧ中Ｔ分。在脊髓灰质炎病毒感染晚期，病毒诱导的包含ＩＡ但一ｍＲＮＡ是缺失些转录起始因子，结合蛋白レッ及大部分ｐｏｌＡｙ（）ｍＲＮＡ。在我们的研究中，ＣＨＸ处理使ＮＤＶ诱导的ＳＧ完全解聚，值得注意的是ＣＨＸ作为一种翻译抑制药物，不但对ＳＧ有解聚作用，病毒蛋白ＮＰ在ＣＨＸ处理之后也几乎完全消失ＣＨＸ不，说明但对宿主蛋白有抑制作用，也抑制病毒蛋白的合成。除此之外，ＳＧ３５ ＴＩＡ－１Ｇ３ＢＰ１和小核糖体蛋白ｒＰ６的标志物ｌＳ翻译起始因子过Ｆ４Ｅ，，，ｅ圧４Ｇ和ｅＩＦ３Ａ均有共定位，说明了病毒感染诱导的ＳＧ为经典型ＳＧ。Ｗ上几章研巧内容证实：ＮＤＶ感染细胞能够诱导稳定性ＳＧ产生，说明ＳＧ的形成是伴随病毒复制的整个过程的，且病毒诱导的ＳＧ并不具备抗病毒颗粒的特性，这些结果提示我们ＳＧ在ＮＤＶ感染过程中或许不发挥掉抗病毒复制的作用，病毒复制能够在ＳＧ存在的状态下复制，或是病毒直接利用ＳＧ成分为自身复制服务，这些即是下一步需要解决的问题。３６ 第五章ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ需要微管蛋白协助５．１前言ＳＧ被认为是一种动态的结构，经典ＳＧ的形成依赖于细胞骨架６６６ｆ＆］成分，尤其是微管蛋白，与此不同的是，细胞骨架似乎在病毒感染诱导的非经典ＳＧ中不发挥作用。目前对微管在各种不同理化因素刺激诱导的ＳＧ中发挥的作用有不同报道。早期的研究结果显示微６６Ｓ刺激诱导的ＳＧｆ３管蛋白的损坏完全抑制了ＡＲｓ。最近的报道显示；微管蛋白的始聚不影响已经形成的ＳＧ的大小和数量，但是显著ｗｆｉ抑制ＳＧ的运动性和动态。同时，有研究证实微管蛋白的更新使ＳＧ运动范围増加，促ｉｔＴＳＧ的的聚合，也就是说微管对于小ＳＧ的６５ｔ］形成没有影响，但他们对大ＳＧ的形成是必要的。我们的上述结果显示病毒感染诱导的ＳＧ较经典ＡＲＳ诱导的ＳＧ相比，大小上明显偏大，我们推测是否ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ与微管蛋白的运输有密切的联系。５．２材料和方法５．２．１病毒和细胞新城疫病毒Ｈｅｒｔｓ／３３毒株由中国兽药监察所提供。将各毒株尿°囊腔接种９旧龄ＳＰＦ鸡胚，在３７Ｃ培养箱中培养，３天（ｄ）后收集尿囊°－７０Ｃ冰箱中液，血凝实验检测病毒滴度，分装冻存于。在鸡胚成纤－维细胞系（ＤＦ１中进行病毒的ＴＣｎＤ５０（半数细胞感染量）的测定）［４８］。人宫颈癌细胞系（ＨｅＬａ）购自中科院细胞库。５．２．２抗体和试剂微管解聚药物Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ（Ｎｏｃ）（Ｍ１４０４），微丝解聚药物ＴＩＡ－ｃｙｔｏ油ａｌａｓｉｎＤ（ｃｙｔｏＤ）（Ｃ８２７３）购自美国ｓｉｇｍａ公司；羊１多－－１－１ｏａｔｏｌｃｌｏｎａｌａｎｔｉＴＩＡＳＣ７５１）购自美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚｅ是隆抗体（ｇ，ｐｙｌｉＤＡＰＩ公司；ｔｕｂｕｎ红色巧光探针，ａｃｔｉｎ绿色巧光探针，购自碧云天生物技术有限公司红色及绿色巧光二抗购自美国ｌｉｆｅ公司。３７ ５．２．３药物处理１）将ＨｅＬａ细胞５Ｘ１０５个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中，用含°Ｃ１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７、５％Ｃ０２细胞培养箱中培养至７０％，２４ｈ后，ｔＵ无血清培养基洗涂细胞３次，加入Ｗ无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅ化／３３毒株ＩｍＬ，病毒感染量为１ＭＯＩ（多重感染复数）°Ｃ２）３７吸附Ｉｈ后，去掉病毒液无血清培养基洗涂细胞３次，加入含ｌ〇Ｈｇ／ｍＬ的Ｎｏｃ或叫ｇ／ｍＬ的ｃｙｔｏＤ，１％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ°％培养基在３７Ｃ、５Ｃ０２细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性对照组细胞一，阴性组除不感染ＮＤＶ外，其它处理方式与病毒感染组致。３）ＮＤＶ病毒感染１２ｈ后收样，去掉培养基，ＰＢＳ洗緣细胞２次，加入４％中性甲酸室温固定２０ｍｉｎ，再ＰＢＳ洗３次。ｔＵ涂细胞３）在湿润的滤纸上放置保鲜膜，在保鲜膜上滴加１００ＵＬ１１０００ＴＢＳ－１：稀释的ＴＩＡ多克隆抗体，再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７Ｘ：解育比后，取出飞片，ＴＢＳ洗緣３遍。４）在保鲜膜上滴加１００ＵＬ１：２００ＴＢＳ稀释的驴抗羊焚光二抗，°再放上含有细胞的飞片，保证抗体与飞片上的细胞完全接触。３７Ｃ避光僻育Ｉｈ后，取出飞片，ＴＢＳ洗涂３遍。５）对ｔｕｂｕｌｉｎ红色焚光探针，ａｃｔｉｎ绿色巧光探针进行染色，°３７Ｃ避光腊育３０ｍｉｎ。６）在载玻片上滴加封片剂，然后放上含有细胞的飞片，用激光共聚焦显微镜观察、摄片。５ｉｎ．３ｔｕｂｕＩ介导ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ的聚集一由于目前关于ｔｕｂｕｌｉｎ对ＳＧ形成的作用还有定程度的争议，病毒感染诱导的一ＳＧ与传统ＳＧ有定的差异，于是我们队ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ是否需要ｔｕｂｕｌｉｎ完整性进行验证，结果显示，对照沮ｔｕｂｕｌｉｎ呈现明显的细丝状排列，说明ｔｕｂｕｌｉｎ探针特异，而用Ｎｏｃ药物处理么后的ｔｕｂｕｌｉｎ则呈弥散状分布于细胞质中，说明Ｎｏｃ破坏了ｔｕｂｕｌｉｎ的完整性，在病毒感染姐，结果显示Ｎｏｃ处理组的ＳＧ并未消失，但是形态明显比对照组圆，且形态上更小，数量上更多（图３８ －ｕｂｕｌ５１）ｉｎ与ＮＤＶ感染诱ＳＧ有关，说明了ｔ导的大。＇．＇－－贈棘Ｖ＇；ＮｏｃＷＨＡ－１ＴｕｂｕｅｅｌｉｎＤＡＰ！Ｍ巧ｉｉｉｉｈｍｂＮｏｃ＊｛｝Ｔ－ＩＡ１ＴｕｂｕｌｉｎＤＡＰＩＭｗｇｅ－ｕｂｕ图５１ｔｌｉｎ与ＮＤＶ感染诱导的大ＳＧ有关－ｎＦｉ．５１ｔｕｌｉｉｓａｓｓｏｃｉａｋｄｗｉ化化ｅ化ｅｆｏｒｍａｔｉｏ凸ｏｆａｒｅｇｂｕｌｇＳＧｉｎｄｕｃｅｄｂｙＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＇５．４ａｃｔＮＤＶｉｎ与诱导的ＳＧ无关已有的报道显示，ａｃｔｉｎ在ＳＧ形成过程中不发挥主要作用，我们对ＮＤＶ感染过程中ａｃｔｉｎ在ＳＧ中的作用进行判定，结果显示，３９ ａｃｔｉｎ在对照组呈现明显的丝状，在ｃｙｔｏＤ处理后发生显著破坏，相应的ｉｎ的解聚对ＮＤＶ感染诱导的，对ＳＧ形成的判定结果显示，ａｃｔＳＧ并无明显影响（图５－２）。．Ｃ－ｙｔｏＤ（）－ｅＡｃｔｉｎＴＩＡ１ＤＡＰＩＭｅ巧ＣｙｔｏＤ＋（）Ａｃ－ｔｉｏ了ＩＡ１ＤＡＰＩＭｅｒｇｅ■■■■■■■■■－２ａｃ图５ｔｉｎ的解聚不影响ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ形成ｉ－Ｆｇ．５１Ｔｈｅｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｎｄｏｅｓｎｏｔｉｎｆｌｕｅｎｃｅｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｆ－ｏＮＤＶｉｎｄｃｕｅｄＳＧ４０ ５．５讨论目前为止关于ｔｕｂｕｌｉｎ在ＳＧ中的作用还存在争议，近期的研巧结果显示ｔｕｂｕｌｉｎ在ＳＧ的形成中不发挥主要在作用，而在ＳＧ的移动６７］和聚集方面发挥重要的体用，我们对ＮＤＶ感染细胞形成的ＳＧ进行判定ＳＧ？，结果湿示，微管的解聚不影响形成，但是导致了小＂＂ＳＧ的形成一Ｐ，这些结果似乎与成熟模型致，即ｍＲＮ颗粒由小Ｍ一过程与ｆｌ口炎聚集至大形成ＳＧ，这ｔｕｂｕｌｉｎ息息相关。水疮性病毒（ＶＳＶ）感染诱导的ＳＧ样结构不需要细胞微管蛋白巧微丝蛋白的一ｆＷ协助种区分ＳＧ样颗粒和经典ＳＧ的区别。我们的结果，这是另显示ｔｕｂｕｌｉｎ在ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ与ＡＲＳ诱导的ＳＧ中发挥相似的一作用。，进步证实了ＮＤＶ感染诱导经典泌４１ 第六章ＳＧ通过调控蛋白翻译系统促进病毒复制６．１前言ＳＧ通常被认为是一种宿主细胞的抗病毒机制，在某些不诱导ＳＧ形成的病毒感染状态下，越来越多的证据证明ＳＧ的形成和病毒复制呈现一种负相关。例如日本脑炎病毒（化Ｖ）病毒核必蛋白与宿主Ｃａｐｒｉｎ１蛋白的相互作用抑制ＳＧ形成，而核也蛋白突变的ＪＥＶ则失去了与宿主Ｃａｐｒｉｎ１蛋白的结合功能，从而使病毒感染不６９能抑制ＳＧ形成ｔ３，导致病毒蛋白翻译和病毒滴度的降低。在其他一一些例子中，病毒诱导ＳＧ样颗粒，这种ＳＧ样颗粒中缺少些经典ＳＧ的关键组分，被称之为抗病毒颗粒（ＡＶＧ），痘病毒感染诱导的ＡＶＧ导致病毒蛋白翻译和病毒滴度的降低这些研究支持上述观点一，即ＳＧ（或ＳＧ样颗粒）是种细胞的抗病毒反应。但在某些情况下，病毒感染细胞诱导稳定存在的经典ＳＧ，这种状态下ＳＧ成分似乎对病毒复制有促进作用－１ＴＩＡＲ或Ｇ３ＢＰ１干扰。例如ＴＩＡ，ＰＳ３的细胞中ＨＣＶＲＮＡ复制，病毒组装和释放均被抑制。呼吸道合胞体病毒（ＲＳＶ）也能诱导经典ＳＧ，Ｇ３ＢＰ的缺失显著抑制ＳＧ的５３［３形成，同时降低了病毒滴度和ＲＮＡ合成量。一些提示一Ｗ上这些报道给我们，即病毒感染诱导ＳＧ的状态定程度上决定了ＳＧ在病毒复制过程中的作用，我们的研究中ＮＤＶ能够诱导稳态经典一ＳＧ产生，与另种副黏病毒科病毒民ＳＶ类似，根据之前的报道我们推测ＳＧ在ＮＤＶ复制中也起到正调控作用，本章对此推测进行实验性证实一，并对其中的机制进步探索。６．２材料巧方法６．２．１病毒和细胞新城疫病毒Ｈｅｒｔｓ／３３毒株由中国兽药监察所提供。将各毒株尿＞°囊腔接种９日齡ＳＩＦ鸡胚，在３７Ｃ培养箱中培养，３天（ｄ）后收集尿囊°液－，血凝实验检测病毒滴度，分装冻存于７０Ｃ冰箱中。在鸡胚成纤维４８［３Ｆ－ＴＣＩＤ５０细胞系（Ｄｎ中进行病毒的（半数细胞感染量）的测定。人宫颈癌细胞系（ＨｅＬａ）购自中科院细胞库。４２ ？？？６．２．２抗体和试剂－曝吟霉素和鼠嚷吟霉素单克隆抗体（ｍｏｕｓｅｉｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｐｕｒｏｍｙｃｉｎ口Ｄ１０，ＭＡＢＥ３４３）购自美国Ｍｅｒ浊Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，鼠－－－ｎａｃｔｉｎ单克隆抗体（Ｍｏｕｓｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉａｃｔｉａｎｔｉｂｏｄｙ，ＰｐＡ巧７ＳｉＩＡ－１．８）购自美国ｇｍａ公司；羊Ｔ多克隆抗体（ｇｏａｔｏｌｃｉ－ＴＩＡ－１－１７１）ＡＲｏａｐｙｌｏｎａｌａｎｔ，ｓｃ５，羊ＴＩ多克隆抗体（ｇｔｌｌ－－ｏｃｏｎａｌａｎｔｉＴＩＡＲ，ｓｃ１７４９）购自美国Ｓａｎｔａｃｍｚｅ公司；小鼠抗ｐｙ核蛋白（ＮＰ）单克隆抗体由本实验室制备。辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记羊抗鼠ＩｇＧ购自美国ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ公司。ｌｉｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００转染试剂，红色及绿色焚光二抗购自美国ｌｉｆｅ公ｐ司。’６．２．３干扰ＲＮＡ，－－－针对ＴＩＡ１的特异性干扰ＲＮＡ（ｓｉＴＩＡ１：５’ＣＵＧＧＧＣＵＡＡＣＡＧＡＡＣＡＡＣＵＡＡＴＴ－３）ＴＩＡＲ，针对的特异性干扰’’ＲＮＡ－－（ｓｉＴＩＡＴ：５ＣＣＣＡＴＡＴＴＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴ３）和无序ＲＮＡ由上海吉玛公司合成。－６．２．４Ｔ干扰ＩＡ１／ＴＩＡＲ后检测蛋白翻译及病毒滴度’Ｖ’１）将ＨｅＬａ细胞＾１０５个接种至３５ｍｍ细胞培养皿中，用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基茫３７ｔ：、５％Ｃ０２细跑培养箱中培养至７０％－，ｌｉｐｏ耗ｃｔａｍｉｎ２０００转染试剂将Ｓ汀！Ａ１／ｓｉＴＩＡＲ转染至ＨｅＬａ细胞中。２）转染４化后，１＾无血清培养基洗緣细胞３次，加入从无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅｒｔｓ／３３奉株ＩｍＬ，病毒感染量为１ＭＯＩ（多重感染复数），３７Ｋ吸附Ｉｈ后，去掉病毒液，Ｗ无血清培养基洗涂细胞３次，加入含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在３７＾：、５％Ｃ０２细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性和阳性对照组细胞，阴性组除不感染ＮＤＶ外一，其它处理方式与病毒感染组致。３）ＮＤＶ病毒感染６，１２，１８，２化后收样，收样之前加ＩｍＭ曝吟霉素标记，去掉培养基，之后用４Ｃ预冷的ＰＢＳ洗涂细胞２＂Ｃ次，在冰上用细胞刮或细胞ｆ产刮取细胞，４４０００ｒ／ｍｉｎ离也５ｍｉｎ，４３ °、去上清，再用ＰＢＳ重悬，４Ｃ４０００ｒ／ｍｉｎ离也５ｍｉｎ，收集细胞上－清，细胞沉淀冻存于７（ＴＣ冰箱供ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白表达，上清０半数细胞感染量的测定－Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒｅｔ进行病毒的ＴＣＩＤ５（）（Ｒｏｍｅｒａｌ．２００３。，）４）在细胞沉淀中加入１２０阵Ｗｅｓｔｅｒｎ及ＩＰ细胞裂解液，再用细°ｎ、胞超声仪破碎细胞Ｉｓ，４Ｃ１２０００ｒ／ｍｉ离也５ｍｉｎ，取上清，用增强型ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，在加入３（ＨｉＬ５ｘ上样缓冲液，煮沸５ｍｉｎ，室温１２０００ｒ／ｍｉｎ离也５ｍｉｎ。５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳；每孔中蛋白上样量为４０惦，先调节电压至恒压８０Ｖ，待蛋白样品从层积胶进入分离胶后，调整电压为１００Ｖ，继续电泳至漠献蓝迁移至分离胶底部。６）蛋白转印－：ＳＤＳＰＡ畑电泳结束后，从玻璃板中将凝胶取出，与三层滤纸、海绵和根据凝胶大小剪好的硝酸纤维素（ＮＣ）膜＂＂一起浸泡于少Ｃ预冷的转印缓冲液中膜正胶负的顺序安装，按照电泳装置－－三层滤纸－－ＮＣ膜－Ｈ层滤纸－－正，及负极海绵凝胶海绵极。加入电泳缓冲液后在冰浴条件下进行转印，转印条件为恒流２５０ｍＡ１．５ｈ。７）转印完成后，Ｗ５％（ｖ／ｗ）脱脂郭室温封闲２ｈ，去除封闲液°，加入１：１０００含１％叠氮钢的巧ＳＴ稀释的抗体，４Ｃ作用过夜，一抗进行回收然后将，ＷＴＢＳＴ洗涂３次，每次ｌＯｍｉｎ。加入－ＨＲＰ二抗１８０００ＴＢＳＴＩＧ，室温作用比，：稀释的羊抗鼠或羊抗兔ｇｉ＾ＴＢＳＴ洗緣３次，每次ｌＯｍｉｎ。８）使用ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌｗｅｓｔｐｉｃｏＣｈｅｍｙｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｌ：ｅｓ试剂盒在暗室中进行显色。将ＥＣＬ显色试剂盒的Ａ液和Ｂ液１：１溜合后－５ｍｉｎＣ膜放置于暗盒内曝光与ＮＣ膜僻育，作用ｌ后，将曝，将Ｎ光的胶片先在显影液中显示目的条带，最后放置于定，自来水冲洗影液中定影。－ｌｉｎｎ发９）ＮＣ膜的民ｅｂｏｔ；光检测后ｇ完成Ｗｅｓｔｅｒ，将膜在蒸一二溜水中漂洗５ｍｉｎ入ｉｎ，再加入足量蒸，加抗抗去除液艇育５ｍ傭水漂洗５ｍｉｎ，后进行上述封闲和抗体作用等步骤。６．２．５ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ条带灰度值计算ＷＩｍａｇｅＪ软件对ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ条带灰度值进行扫描，将目的基４４ 因条带灰度值与内参基因ａｃｔｉｎ条带灰度值扫描后比对，计算出相对灰度值，绘制柱状图。６－．３ＴＩＡ１的干扰降低病毒蛋白翻译的同时增加细胞总蛋白的翻译－ＴＩＡ－１ＳＧ形Ｇ由于是成的关键基因，ＴＩＡ１的干扰能够诱导Ｓ形成受阻－１进，因此我们首先选取ＴＩＡ行干扰试验，结果显示，与－对照组相比ｉＴＩＡ１的干扰效率达到了９０％１＾上。病毒蛋白在感染，ｓ－后１２ｈ可被检测到，相应的，在干扰ＴＩＡ１组病毒ＮＰ蛋白量有显著降低（１２ｈ１８ｈ），２４ｈ，尤其是在病毒感染中后期和而在感染后－１）１２ｈ则没有显著的影响（图６。灰度扫描结果也证实了感染后和－ｉ－６２）１８ｈ，ｓＴＩＡ１组的ＮＰ量与对照组相比显著降低（图。我们对嚷岭霉素标记的新合成的蛋白进行检测；在感染后各个，结果显示－时间点－１组６，ｓｉＴＩＡ的总蛋白合成与对照组相比均有明显上升（图－－１６２）。这些结果显ｉＴＩＡ１，示ｓ导致病毒蛋白翻译量的减少和总蛋白翻译量的上升。Ｍｏｃｋ巧１２１８２４ｈｐｉ－＋－＋－＋－＋－＋ｓ－１ｉＴＩＡ－ｉ．、＇巍塞．—ＮＰｍｍｍｍ．ｍｍＴ－ＩＡ１＊＊＾口ａｃｔｉｎ＊＂＊ｉＭｆＩＭｔＭＵＭｌ■■？－－图６１ｓｉＴＩＡ１对病毒和宿主总蛋白翻译水平的影响４５ －－ｔＴｎｔｔｔｒｌａｔｉｖｉｒａｌａｎｄｈｏｓｒｏｅｉｎａｎｓｏｎｓ巧．６１ＴｈｅｉｍａｃｏｆｓｉＩＡ１ｏ３ｐｐＡＢＣＵＤ＿Ｓｃｒａｍｂｌｅ－－ＭＵｓＡ０．４１口Ｓｃ巧ｍｂｉｅｉＴＩ１圓ｓ－巧ｉＴＩＡ１－－－６０巧．３ａｉｉ曲＊Ｉｉ＾：４｜｜ｊｌＭｏｃｋ６ｈ１２ｈ１８ｈ２４ｈ１２ｈ１８ｈ２４ｈ－－图６２ｓｉＴＩＡ１和对照细胞总蛋白／ＮＰ与内参基因灰度比值－ｔｎ－ｒｏＦｉｉｔｒａｔｉｏｏｆｃｅｌｌｌｏｂａｌｔ；ｅｉｎ／ＮＰ化ａｃｉｇ．６２ＴｈｅＤｅｎｓｏｍｅｔｒｙｇｐｐｂａｎｄ－ｎｓｉｎｓｉＴＩＡ１ａｎｄｃｏｔｒｏｌｃｅｌｌｓ－。６．４Ｔ１ＩＡ的干扰导致细胞上清中病毒滴度的降低－ＴＣＩＤ５０的滴定对上述ＴＩＡ１干扰后的细胞上清进行病毒，结一１２１８ｈ果显示；与蛋白翻译水平致，与对照组相比，在感染后和组－１组。但在病毒感染的初期，ｓｉＴＩＡ细胞上清中的滴度显著降低化２４ｈＴＩＡ－１对病毒复制的（）和后期（）并没有显著性差异，说明４６ 控作用具有时效性（图６－３）。７Ｓｃｒａｍｂｌｅ］－二ＴｓｉＴＩＡ１Ｅ＇－Ｓ６．．ＺＩ－？６ｈ１２ｈ化ｈ２４ｈ图６－３ｓ汀ＩＡ－１对细胞上清中病毒滴度的影响－ｈｅｍｔ－Ｆｉｇ．６１ＴｉｐａｃｏｆｓｉＴＩＡ１ｏｎｖｉｒａｌｔｋｅｒｉｎｔｈｅｃｅｌｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ６．５ＴＩＡＲ的干扰降低病毒蛋白翻译水平和病毒滴度ＴＩＡ－Ｉ和ＴＩＡＲ均是ＲＮＡ结合蛋白，在翻译抑制和ＳＧ形成过程中发挥相似的作用因此我们对内源性ＴＩＡＲ也进行干扰后感染ＮＤＶ，观察ＴＩＡＲ在ＮＤＶ复制中的作用。结果显示；与对照组相比－，干扰ＴＩＡＲ组病毒ＮＰ蛋白量有显著降低，同ＴＩＡ１类似，也是－４）在病毒感染中后期（１２ｈ和１８ｈ）（图６。灰度扫描结果也证实了感染后６ｈ和－１组－１２ｈ，ｓｉＴＩＡ的ＮＰ量与对照沮相比显著降低（图６５）。我们对嚷吟霉素标记的新合成的蛋白进行检测，结果显示；在感染后各个时间点，Ｓ订ＩＡ民组的总蛋白合成与对照组相比均有明显上升－－（图６４，６５）。对ＴＩＡＲ干扰后的细胞上清进行病毒ＴＣＩＤ５０４７ 的滴定－，结果显示：与对照组相比，在感染后６和１２ｈ组，ｓ汀ＩＡ１Ｍｏｃｋ６ｈ１２ｈ１８ｈｓ－＋－＋－ｉＴＩＡＲ＋＋ＭｍＩＮＲｗＩｌｌ補ｌｉ资達’＇＃辦隹ＴＩＡＲ麵ＩＰ－ｐａｃｔｉｎ禱雜嚇《０晴翻編娜組细胞上清中的滴度显著降低（图６－６）。图６－４ｓｉＴＩＡ民对病毒和宿主总蛋白翻译水平的影响－Ｆｉ－ｒａａｎｄｒｏｉｇ．６４ＴｈｅｍｐａｃｔｏｆｓｉＴＩＡ１ｏｎｖｉｌｈｏｓｔｌｏｂａｌｔｅｉｎｇｐＡＢｂｌｅＳｗｅ己６己ｓ爷端ｓｊ墨＾ｆｃ－ｉｒｊｊＩ３－￣ｌｉ．－ｒＪｌ—Ｉ？，ｏ〇ＰＰＰ．ｏ〇Ｐ］＾｜ＩＰＭｏｃｋ６ｈ１２ｈ１８ｈ１２ｈ１８ｈｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ６－５图ＳｉＴＩＡＲ和对照细胞总蛋白／ＮＰ与内参基因灰度比值－－Ｆｉ；ｒｇ．６５ＴｈｅＤｅｎｓｉｌｏｍｅｔｙｒａｔｉｏｏｆｃｅｌｌｌｏｂａｌｒｏｔｅｉｎ／ＮＰＵ）ａｃｔｉｎｇｐｐ４８ ｂａｎｄｓｉｎｓｉＴＩＡＲａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓ７－ｉｋ－Ｓｃｒａｍｂｌｅ］３－Ｂ－ｓ订ｌＡＲ１３１Ｉｉ６ｈ１２ｈ１８ｈ图６－６ｓ汀ｌＡＲ对细胞上清中病毒滴度的影响－化ｅｃｅＦｉ，６６ＴｈｅｉｍａｃｔｏｆｓｉＴＩＡＲｏｎｖｉｒａｌｔｉｔｅｒｉｎｌｌｓｕｅｒｎａｔａｎｔｇｐｐ６．６讨论对于细胞而言一，ＳＧ提供了种固有的括抗病毒的机制，相应的一，病毒试用系列抵抗机制来逃避甚至利用ＳＧ来有利于自身复制。许多病毒通过许多不同的机制来括抗ＳＧ形成，例如Ｇ３ＢＰ的切ＰｈＷ害师ＰＫＲ的失活。与此相反，ＨＣＶ和民ＳＶ能够诱导稳定存在的经典ＳＧ，换句话说，ＳＧ的形成伴随着病毒的复制病毒一感染与ＳＧ的这种共生关系让我们推测是否ＳＧ并非种措抗机制，而是病毒复制的有利因素。事实上，在这些例子中，ＳＧ关键成分，－例如ＴＩＡ１，ＴＩＡＲ或Ｇ３ＢＰ的缺失抑制了病毒的复制，说明了ＳＧ在病毒复制中发挥正向调控的作用。类似的，在我们的研究中，ＮＤＶ感染能够诱导稳定存在的经典ＳＧ－。ＴＩＡ１和ＴＩＡＲ的干扰降低了病毒蛋白的合成和病毒粒子的释－放，尤其在病毒感染的中后期，说明ＴＩＡ１和ＴＩＡ民对ＮＤＶ复制有利。值得注意的是，ＳＧ有利于病毒复制的具体机制至今还为阐明，４９ Ａ－１我们的实验证实，ＴＩ和ＴＩＡＲ的干扰导致宿主总蛋白翻译水平的上升，这种蛋白翻译水平的上升是否与其有利于病毒复制有关有待一步证实下。５０ 第Ｈ：：章ＳＧ主要包裹宿主总ｍＲＮＡ而非病毒ｍＲＮＡ７．１前言由于ＳＧ主要是包裹未翻译的ｍＲＮＡ，使翻译暂时停滞，或者将ｍＲＮＡ运送至Ｐ小体中降解。因此在病毒感染的细胞中，涉及到ＳＧ包裹的ｍＲＮＡ成分为主要是宿主亦或是病毒的ｍＲＮＡ。对ＲＳＶ的研究表明，病毒ｍＲＮＡ主要位于病毒的翻译复合体中，而仅有少３Ｐ３部分与ＳＧ有共定位。脊髓灰质炎病毒感染的细胞中，ＳＧ主要包裹宿主ｍＲＮＡ，对病毒ｍＲＮＡ几乎没有包裹在这些例子中，病毒ｍＲＮＡ极有可能通过某种机制逃逸ＳＧ的包裹，从而逃逸宿主的翻译抑制机制，在细胞中继续进巧蛋白翻译。ＳＧ关键姐分Ｔ－１本研究中，对ＩＡ和ＴＩＡＲ的干扰导致ＮＤＶ蛋白翻译水平下降和宿主翻译水平的上升，我们推测是否与脊髓灰质炎病毒类似，ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ也是主要包裹宿主ｍＲＮＡ而非病毒ｍＲＮＡ，本章对此推测进行实验证实。７．２材料和方法７．２．１病毒和细胞新城疫病毒扫ｅｒｔｓ／巧毒株由中国兽药监察所提供。将各毒株尿°囊腔接种９日龄ＳＰＦ鸡化在３７Ｃ培养箱中培养，３天州后收集尿囊°－７０Ｃ冰箱中液。在鸡胚成纤维，血凝实验检测病毒滴度，分装冻存于细胞系－１ＴＣＩＤ５０（ＤＦ）中进行病毒的（半数细胞感染量）的测定人宫颈癌细胞系（ＨｅＬａ）购自中科院细胞库。７．２．２抗体和试剂－－－－羊ＴＩＡ１多克隆抗体（ｇｏａｔｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉＴＩＡ１，ＳＣ１７５１），羊ｐＴＩＡＲ多ｏａｏ－ＴＩＡＲ－克隆抗体（ｇｔｐｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉ，ＳＣ１７４９）购自美国Ｓａｎｔａｃｒｕｚｅ公司；ｐｏｌｙ（Ａ），ＮＰｍＲＮＡ探针，ＦＩＳＨ试剂盒购自美国Ａｆｆｙｍｉｔｒｉｘ公司。红色及绿色巧光二抗购自美国ｌｉｆｅ公司。ＤＡＰＩ购自碧云天生物技术有限公司。５１ ７．２．３巧光原位杂交（ＦＩＳＨ）５１）将ＨｅＬａ细胞ｌｘｌ〇个接种至２４孔细胞培养板中（培养皿中事先放置已灭菌的细胞飞片），用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基在°３７Ｃ、５％Ｃ０２细胞培养箱中培养至７０％，２４ｈ后，无血清培养基洗緣细胞３次，加入无血清培养基稀释的ＮＤＶＨｅｒｔｓ／３３毒株°ＩｍＬ，病毒感染量为１ＭＯＩ（多重感染复数），巧０吸附比后，去掉病毒液，［＾无血清培养基洗緣细胞３次，加入含１０％ＦＢＳ的°ＤＭＥＭ培养基在３７Ｃ、５％Ｃ０２细胞培养箱中继续培养。同时设置阴性和阳性对照姐细胞，阴性组除不感染ＮＤＶ外，其它处理方式一致与病毒感染姐。２）ＮＤＶ病毒感染６，１２，１８１１后，去掉培养基，ＰＢＳ洗涂细胞？２次，按照Ａｆｉｍｉｔｒｉｘ公司ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅＶｉｅｗＲＮＡＣｅｌｌＡｓｓａｙｋｉｔ试剂盒进行后续操作。７－．３ｍＲＮＡＮＤＶ感染后期与ＴＡ１宿主总在Ｉ共定位由于病毒感染诱导的ＳＧ通过调控蛋白翻译系统对ＮＤＶ复制有利，为了确证ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ中主要包裹宿主ｍＲＮＡ还是病毒ｍＲＮＡ，我们检测了细胞总ｍＲＮＡ和病毒的ｍＲＮＡ与ＳＧ标志蛋白的共定位，结果显示宿主总ｍＲＮＡ在对照组细胞中均匀分布在细胞质中，但在病毒感染中后期（１２，１化），典型ＳＧ形成后，几乎所有ｍＲＮＡ都与ＴＩＡ－１有共定位，说明总ｍＲＮＡ被招募至病毒感染诱导７－１）Ｐ的ＳＧ中（图。与此不同的是，病毒Ｎ的ｍＲＮＡ在感染后弥散性分布于细胞质中，感染后１化ＳＧ形成后，仅有少部分ＮＰｍＲＮＡＰｍＲＮＡ不与ＴＩＡ－－被招募至ＳＧ中，大部分Ｎ１共定位（图７２）。５２ Ｔ－ＰｏｌｙＡＰｒｏｂｅＩＡ１ＤＡＰｌＭｅｒｅｚｏｏｍｇＭｉｋ迪＾匿纖如以姚１１ｍｍｍｍｍ■■■—■■■■—■－图７１宿主总ｍＫＮＡ与ＴＩＡ－ｌ在ＮＤＶ感染后期共定位ｉ－ｗｅｅｎＦ．７１ＴｈｅｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｔｅｒｎｂｅｔｃｅｌｌｔｏｔａｌｏｌＡｇｐｐｙ（）ＴＩＡ－１ｔ也ｍＲＮＡａｎｄａｅｌａｔｅｓｔ；ａｅｏｆＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇ曲？曲曲３ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ５３ －２少部分病毒ＮＰ－图７ｍＲＮＡ与ＴＩＡ１在ＮＤＶ感染后期共定位－－Ｆｉ．７２ＡｓｍａｌｌｏｒｔｉｏｎｏｆＮＰｍＲＮＡｌｏｃａｌｉｚｅｄｗｉｔｈＴＩＡ１ａｔ化ｅｇｐｌａｔｅｓｔａｅｏｆＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇ７．４宿主总ｍＲＮＡ在ＮＤＶ感染后期与ＴＩＡＲ共定位上述结果盈示ＴＩＡ民与ＴＩＡ－１有相似的促进病毒复制的功能，因此推测ＴＩＡＲ与ＴＩＡ－１类似，与宿主ｍＲＮＡ共定位。我们ＷＴＩＡＲ作为ＳＧ标志重复５．３ＦＩＳＨ实验，结果证实病毒感染中后期宿主总－３ＮＰｍＲＮＡ则仅有小部分与ｍＲＮＡ与ＴＩＡＲ共定位（图７），而病毒ＴＩＡＲ７－共定位（图４）。ＰｏｌｙＡＰｒｏｂｅＴＩＡＲＤＡ円Ｍｅｒｇｅｚｏｏｍ■■■圍■■■国国图７－３宿主总ｍＲＮＡ与ＴＩＡＲ在ＮＤＶ感染后期共定位Ｆ－ｉｇ．７３Ｔｈｅｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｔｅｒｎｂｅｔｗｅｅｎｃｅｌｌｔ；ｏｔａｌｏｌＡｐｐｙ（）ｍＲＮＡａｎｄＴＩＡＲａｔｔｈｅｌａｔｅｓｔａｇｅｏｆＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ５４ ＴＩＡＲＮＰＰｒｏｂｅＤＡＰＩＭｅｒｇｅｚｏｏｍ国■圓国閉ｍｍｍｍｍ－４少部分病毒ＮＰ图７ｍＲＮＡ与ＴＩＡＲ在ＮＤＶ感染后期共定位－化ＴＩＡＲａｔ出ｅＦｉ．７４ＡｓｍａｌｌｏｒｔｉｏｎｏｆＮＰｍＲＮＡｌｏｃａｌｉｚｅｄｗｉｇｐｌａｔｅｓｈｅｏｆＮＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇ７．５讨论？＊已有的研究表明一，ＳＧ除了作为种抗病毒机制之Ｉｔ，还有可能被病毒利用为自身复制服务，本文对ＳＧ在病毒复制中的作用进行了研究，主要结果包括；（１）病毒通过磯酸化ｅＩＦ２ａ抑制细胞总蛋－１／ＴＩＡ民干扰ＲＮＡ能够提高总蛋白翻译水平白翻译，而转染ＴＩＡ；－（２）ｓｉＴＩＡ１／ＴＩＡＲ均能抑制ＮＤＶ病毒蛋白表达和病毒粒子释放；（３）ＮＤＶ感染诱导的ＳＧ中主要包含宿主ｍＲＮＡ，而大部分病毒ｍＲＮＡ不与ＳＧ共定位。基于上结果，我们提出了レッ下假说；ＮＤＶ感染细胞之后，细胞Ｗ形成ＳＧ的方式暂停蛋白翻译来阻止病毒蛋白翻译和病毒复制，同时也包裹了宿主ｍＲＮＡ，而病毒ｍＲＮＡ通过一种未知机制逃逸出ＳＧ的包裹后继续翻译。将ＳＧ关键基因ＴＩＡ－１／ＴＩＡＲ干扰后阻断了ＳＧ的形成，从ＳＧ中释放的宿主ｍＲＮＡ转移至与多聚核糖体进行翻译，从而竞争性的降低病毒蛋白翻译水平。５５ 我们的数据和假说符合已有的报道，西口利克森林病毒能够通过促进ｅＩＦ２ａ憐酸化抑制总蛋白翻译，但是在ＴＩＡ１敲除鼠成纤维细ＰＷ－胞中这种翻译抑制发生延迟。ＴＩＡ１和ＴＩＡＲ都是ＲＮＡ结合蛋白能够Ｗ相似的方式抑制翻译和促进ＳＧ形成除了ＴＩＡ－１／ＴＩＡＲ么外，其他的细胞蛋白也参与了ＳＧ的形成，例如Ｇ３ＢＰ１和Ｇ犯Ｐ２在许多人类细胞中共同调控ＳＧ形成在Ｇ３ＢＰ１干扰的细胞中，ＲＳＶ的复制受到了抑制。脆性Ｘ智力障碍蛋白（ＦＭＲＰ）作为另外一种ＲＮＡ结合蛋白也能够将ｍＲＮＡ招ＳＧ中促进翻译停滞募至，这些ＲＮＡ结合蛋白或其他未鉴定的ＳＧ成分是否也对ＮＤＶ诱导的ＳＧ一步证实有促进作用还有待进。５６ 结论１．本研巧首先证实了ＮＤＶ感染细胞之后能够诱导稳定存在的应激颗粒２．ＮＤＶ主要通过复制过程中产生的双链ＲＮＡ激活ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ通路抑制宿主细胞总蛋白的翻译，促进ＳＧ的形成３．ＮＤＶ感染细胞诱导的ＳＧ是经典ＳＧ，包含小核糖体亚基和典型的翻译起始因子４．微管蛋白对ＮＤＶ感染诱导的大ＳＧ形成有至关重要的作用５．ＳＧ对ＮＤＶ复制有正向调控作用，通过持异性的招募宿主而非病毒ｍＲＮＡ，通过调控宿主和病毒蛋白翻译平衡来促进病毒复制５７ 致谢感谢国家博古后面上资助（２０１４Ｍ５５０１０７）自然科学基金青年基金（３１４００１４４），上海市青年科技英才杨帆计划（１４ＹＦ１４０８０００）及中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（２０１４ＪＢ０８Ｖ给予的大力资助。感谢中国农业科学院上海兽医研究所提供优秀的实验条件。特别感谢于圣青研究员给予实验上的悉也指导和文章撰写上的细也修改，感谢下伊研究员在实验思路上给予的耐也指点和宝贵建议。感谢本实验室其他老师工作上给予的大力支持。感谢中也实验室赵枝新．、刘定涛、张北民和乔长涛老师给予的大力协助。感谢张石磊和王晓旭同学在课题初期积极的探索，特别感谢董路娜同学在课题上给予的大为帮助。感谢所有两年间所有帮助过我的人！，谢谢５８ 参考文献１ＫｅｄｅｒｓｈａＮＣｈｅｎＳＧＨｋｓＮｅｔａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ化ａｔｔｏｎａｒｃｏｍｌｅｘ［］，，，ｙｐ－ｅＩＦ２－ＧＴＰ－ｔＲＮＡｄｅｆｉｃｔｒｅＭｅｔｉｅｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｃｏｍｌｅｘｅｓａｒｅｃｏｒｅ（（〇（））ｐｐｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｓ．ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ２００２１３１：ｇ口］，，（）１％－２１０．２Ｗｅｋ艮ＣＪｉａｎＨＹＡｎ也ｏｎＴＧ．Ｃｏｉｎｗｉ出ｓｔｒｅｓｓ：ｅＩＦ２ｋｉｎａｓｅｓ［］，ｇ，ｙｐｇａｎｄ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌＪ．ＢｉｏｄｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ２００６３４Ｐｔ１：７１１．［］，，（）３ＭｏｎｅｒｏＨＴｒｕ－ｔｉｌｌｏＡｌｏｎｓｏＶ．Ｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｓｉｎｔｈｅｖｉｒａｌｒｅｌｉｃａｔｉｏｎ［］，ｊｇｐｃｃ－ｙｌｅ口？Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１１３１１：２３２８３８．］，（）［４］ＤａｎｇＹ，ＫｅｄｅｒｓｈａＮ，ＬｏｗＷＫ，ｅｔａｌ．ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃＵｊｒ２ａｌｈａ－ｎｄｅｔｒａｎｕｕｃｎｂｎａｕｒａｐｉｐｅｎｄｅｎａｔｈｗａｏｆｓｔｒｅｓｓｌｅｉｎｄｔｉｏｔｈｅｔｌｐｙｇｙｒｏｄｕｃａａｍｎｅ－ｔｔｅｉＡＪ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００６２８１４３：３２８７０８．ｐｐ［］，，（）５Ｍａｚｒｏｕｉ艮Ｓｕｋａｒｉｅｈ民ＢｏｒｄｅｌｅａｕＭＥｅｔａｌ．Ｉｎｈ化ｉｔｉｏｎｏｆｒｉｂｏｓｏｍｅ［］，，，ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｉｎｄｕｃｅｓｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｌｏｆｅｕｋａｒｏｔｉｃｇｐｙｙｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ２ａｌｈａｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎ口．ＭｏｌＢｉｏｌＣｄｌ２００６１７１０：ｐｐｐｙ］，，（）４２１２－９．［６］ＥｍａｒａＭＭ，ＦｕｊｉｍｕｒａＫ，ＳｃｉａｒａｎｇｈｅｌｌａＤ，ｅｔａｌ．ＨｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｉｎｄｕｃｅｓｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｏｆｅＩＦ２ａｌｈａｇｐｐｈｏｓｈｏｒａｔｍｍｕｎ－ｌｉｏｎ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｈｓ民ｅｓＣｏ２０１２４２３４：７６３９．ｐｐｙ口］ｐｙ，，（）７Ｒｅｒｅｔｒ－ｎｄｕｃｅｄｉｎｅｋｅＬＣＤｏｕｈｅｒｔＪＤＰｉｅｒＰｅａｌ．ＬａｅＧ３ＢＰｉ［］，ｇｙ，，ｇｇｒａｎｕｌｅｓｔｒｉｇｇ巧ｅＩＦ２ａｌｐｈａｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ口］？ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ，２０１２，２３１８３４９９－１０．（）：５Ｋ＇［８］ＯｈｎＴ，ｅｄｅｒｓｈａＮ，ＨｉｃｋｍａｎＴ，ｅｔａｌ．ＡｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＲＮＡｉｓｃｒｅｅｎｌｉｎｋｓ－ｍａＯＧｌｃＮＡｃｍｏｄｉ打ｃａｔｉｏｎｏｆｒｉｂｏｓｏｌｐｒｏｔ；ｅｉｎｓｔｏｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅａｎｄｇＢｉｏｌ－ｒｏｃｅｓｓｉｎｂｏｄａｓｓｅｍｂｌＪ．ＮａｔＣｅｌｌ２００８１０１０：１２２４３１．ｐｇｙｙ［］，，（）－９Ｋｅｄｅｒｓｈａ－ＮＬＧｕｔａＭＬｉＷｅｔａｌ．ＲＮＡｂｉｎ出ｎｒｏｔｅｉｎｓＴＩＡ１ａｎｄ［］ｐ，，ｇｐ－ＴＩＡＲｌｉｎｋｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｅＩＦ２ａｌｐｈａ化ｔ；ｈｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｍａｍｍａｎｒｅｓｓ－ｌｉａｓｔｒａｎｕｌｅｓＪ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１９９９１４７７：１４３１４２．ｇ［］，，（）１０ＫｅｄｅｒｓｈａＮＳｔ；ｏｅｃｋｌｉｎＧＡｏｄｅｌｅＭｅｔａｌ．Ｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｓａｎｄ［］，，ｙ，ｇｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｂｏｄｉｅｓａｒｅｄｎａｍｉｃａｌｌｌｉｎｋｅｄｓｉｔｅｓｏｆｍＲＮＰｒｅｍｏｄｅｌｉｎＪ．Ｊｙｙｇ［］Ｃｅ－ｌｌＢｉｏｌ２００５１６９６：８７１８４．，，（）１ｈｉｔｅＪＰＬｌｏｄ民Ｅ．ＰｏｌｉｏｖｉｒｕｓｕｎｌｉｎｋｓＴＩＡｌａｒｅａｔｉｏｎａｎｄｍＲＮＡ［ＵＷ，ｙｇｇｇ５９ 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２０１２－％口３：１２６Ｗ７０７．，）２３ＱｎｏｍｏｔｏＫＪｏｉＭＹｏｏＪＳｅｔａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｏｆａｎａｎｔｉｖｉｒａｌｓｔｒｅｓｓ［］，ｇ，，ｒａｎｕｔａｎｎ－ｎｄＰＫＲｖｒａｎａｎｄｎｎａｔｅｇｌｅｃｏｎｉｉｇＲＩＧＩａｉｎｉｌｄｅｌｅｔｉｏｉｉｍｍｕｎｉｔＪ．ＰＬｏＳＯｎｅ２０１２７８：ｅ４３０３１．ｙ，［］，（）２ｏｎｔｅｒｏＨ民ｏａｓＭＡｒｉａｓＣＦｅｔａｌ．民ｏｔａｖｉｍｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓ也ｅ［句Ｍ，ｊ，：ｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎｏｆｅＩＦ２ａｌｈａｂｕｔｒｅｖｅｎｔｓｔｈｅ化ｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓｐｐｙｐｐｒａｎｕ－ｌｅｓＪ．ＪＶｉｒｏｌ２００８８２３：１４９６５０４．ｇ［］，，（）［２５］ＱｉｎＱ，ＣａｒｒｏｌｌＫ，ＨａｓｔｉｎｇｓＣ，ｅｔａｌ．Ｍａｍｍａｌｉａｎｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓｃａｐｅｆｒｏｍｈｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｓｈｕｔ；ｏｆｆｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｄｉｓｒｕｔｉｏｎａｎｄｇｐｉｓｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｏｆｅＩＦ２ａｌｈａｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎａｎｄＰＫＲ．ＪＶｉｒｏｌ２０１１ｐｐｐｐｙ口］，，８５－１７：８７９８８１０．（）２６ｉｎＨａｓｔｉｎｓＣＭｉｌｌｅｒＣＬ．Ｍａｍｍａｌｉａｎｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓａｒｔｉｃｌｅｓ［］ＱＱ，ｇ，ｐｉｎｄｕｃｅａｎｄａｒｅｒｅｅｍｋｅｄｉｎｔｏｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｓａｔｅａｒｌｔｉｍｅｓｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ｇｙｐ口］Ｊ－Ｖｉｒｏｌ２００９３２１１１０９０１０１．：，，８（）［２７］ＲｕｇｇｉｅｒｉＡ，ＤａｚｅｒｔＥ，ＭｅｔｚＰ，ｅｔａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｍａｒｋ化ｅｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｏｎｓｅ化ｖｉｒｕｓｇｐ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎＪ．ＣｅｌｌＨｏｓｔＭｉｃｒｏｂｅ２０１２１２：７１８５．［］，，。）ａｒａｉｏｒｔａＵＨｅｉｍＭＨＢｏｄＢｅｔａｌ．ＨｊａｔｉｔｉｓＣｖｉｍｓＣＶ口別Ｇｇ，，ｙ，ｑ巧）ｉｎｄｕｃｅｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓｇｒａｎｕｌｅｓｗｈｏｓｅｒｏｔｅｉｎｓｒｅｕｌａｔｅＨＣＶＲＮＡｐｇｒｅｌ－ｉｃａｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｕｓａｓｓｅｍｂｌａｎｄｅｒｅｓｓＪ．ＪＶｉｒｏｌ２０１２％２０：１１０４３ｐｙｇ［］，，（）５６．２ａａｂｅｎＭＧｒｏｏｔＫｏｅｒｋａｍＭＪＲｏｔｉｅｒＰＪｅｔａｌ．Ｍｏｕｓｅｈａｔｉｔｉｓ［引Ｒ，ｐ，，巧ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｓｈｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｓｈｕｔｏｆｆａｎｄｍＲＮＡｐｄｅｃａｙ，ｗｉｔｈｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓｇｒａｎｕｌｅｓａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｂｏ出ｅＪ－ｓ．ＣｅｌｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２００７９９２２１８２９．，，：［］（）３０！！！ＩＮＶＡＬＩＤＣＩＴＡＴＩＯＮＵ！［］－？３１ＳｏｌａＩＧａｌａｎＣ；ｅｏｓＧｏｍｅｚＰＡｅｔａｌｔｒａｔＭａｔ．Ｔｈｅｏｌｒｉｍｉｄｉｎｅｃ［］，，，ｐｙｐｙｂｉｎｄｉｎｒｏ化ｉｎａｆｅｃｔｓｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓＲＮＡａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓａｎｄｇｐｒｅｌｏｃａｌｉｚｅｓｖｉｒａｌＲＮＡｓ！：〇ｎｏｖｅｌｃｙｔｏｌａｓｍｉｃｄｏｍａｉｎｓｄｉｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｐ－ｒｅｃａｏｎ－ｔｒａｎｓｌｉｔｉｃｒｉｔｉｏｎｓｉｔ；ｅｓＪ．ＪＶｉｒｏｌ２０１１８５１０：５１３６４９．ｐｐ［］，，（）；化ｅｋＨｔｌｔｒｓｔ３ＣｒｉｓｔｅａＩＭＲｏｚＭｏｌｌｏＫ民ｅａ．Ｈｏｓ化ｃＵ）ａｓｓｏｃｉａｅｄ［＾，ｊ，ｙ，ｗ地化ｅＳｖｍ－ｄｅｔｍｅｒａｉｎｄｂｉｓｉｓＲＮＡｐｅｎｄｅｎＲＮＡｏｌｓｅ：ｒｏｌｅｆｏｒＧ３ＢＰ１ｐｙａｎｄＧ犯Ｐ２－ｉｎｖｉｒｕｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｎ＾．ＪＶｉｒｏｌ２０１０８４；３：６７２０３２．ｐ，，ｙ）－３３ＦｒｏｌｏｖａＥ，ＧｏｒｃｈａｋｏｖＲ，ＧａｒａｉａｓｈｏｖａＮｅｔａｌ．ＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｎｓＰ３［］，６１ 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５５ＭａｓｔｅｒｓＰＳＢａ打ｅｒｅｅＡＫ．Ｃｏｍｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉ化ｖｅｓｉｃｕｌａｒ［］，ｊｐｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎＮＳｐｒｅｖｅｎｔｓｂｉｎｄｉｎｇｏｆｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｒｏｎ－；ｅ）ｎｉｆｉ．Ｖｉｒｌ％８６２：６４１ｉＮＵｏｎｓｅｃｃＲＮＡＪＪｏ１２６％．ｐｐ［］，，巧）５６ＣｕｒｒａｎＪ，ＲｅｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳｅｎｄａｉｖｉｍｓＰｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓ［］ｐｒｅｕｉｒｅｄｆｏｒＲＮＡｓｎｔｈｅｓｉｓ：ａｏｓｓ化ｌｅｓｕｌｅｍｅｎｔ；ａｌｒｏｌｅｆｏｒｔｈｅＰｑｙｐｐｐｉｎ－ｒｏｔｅＪ．Ｖｉｒｏｌｏ１９９６２２１１１３０４０．：ｐ［］ｇｙ，，（）５７ＫｅｄｅｒｓｈａＮＡｎｄｅｒｓｏｎＰ．Ｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｓ：ｓｋｅｓｏｆｍ民ＮＡｔｒｉａｅｔｈａｔ［］，ｇｇｒｅｕｌａｔｅｍＲＮＡｓｔａｂｉｌｉｔａｎｄｔ；ｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔＪ．ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ，２００２ｇｙｙ［］，３－（Ｐｔ６９６３９．Ｋ）：［５８］ＫｅｄｅｒｓｈａＮ，ＩｖａｎｏｖＰ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＰ．Ｓｔｒｅｓｓｇｒａｎｕｌｅｓａｎｄｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｍｏｒｅ化ａｎｊｕｓｔａｐａｓｓｉｎｇｐｈａｓｅ？口］．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ，２０１３，３８（１０）：４９４－５０６．９Ｇａｉｎ巧ＭＤＤｉｌｒＫＭｒａｘｏｖｒ－ｌｏｎＰＪＣｌａｋｅｔａｌ．Ｐａｍｉｕｓｉｎｄｕｃｅｄ口］，，，ｙｓｈｕｔｏｆｆｏｆｈｏｓｔａｎｄｖｉｒａｌｒｏ１；ｅｉｎｓｎｔｈｅｓｉｓ：ｒｏｌｅｏｆｔｈｅＰａｎｄＶｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐｙｐｎｔｉｒｏ－ｌｉｍｉｔｉＰＫＲａｃｔｉｖａｏｎ．ＪＶｉｌ２００８８２２：８２８３９．ｇ…，，（）［６０］ＺｈａｎｇＳ，ＳｕｎＹ，ＣｈｅｎＨ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ化ｅＰＫＲ／ｅＩＦ２ａｌｐｈａｓｉｇｎａｌｉｎｇｃａｓｃａｄｅｉｎｈ化ｉｔｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｅｗｃａｓｔｌｅ化ｓｅａｓｅｖｉｍｓ．Ｖｉｒｏｌｐ口］Ｊ２０１４１１．：６２，，６１ＮＣＳＪｏｉＭＹｏｏＪＳｅｔａｌ．Ｅｎｃｅｈａｌｏｍｏｃａｒｄｉｔｉｓｖｉｍｓｄｉｓｒｕｔｓ［］ｇ，ｇ，，ｐｙｐｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｓ也ｅｃｒｉｔｉｃａｌｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｔｒｉｅｒｉｎａｎｔｉｖｉｒａｌｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｇ，ｐｇｇｇｒｅｓＪ－ｏｎｓｅｓ．ＪＶｉｒｏｌ２０１３，８７１７．：Ｗｌｌ２２ｐ［］，（）６２ｒｓｈａ－ＫｅｄｅＮＣｈｏＭＲｉＷｅｔａｌ．ＤｎａｍｉｃｓｈｕｔｔｌｉｎｏｆＴＩＡ１［］，Ｌ，，ｙｇｉｔｈｉｔｔｔｌｉｔｒｌａｃｃｏｍｐａｎｅｓｅｒｅｃｒｕｍｅｎｏｆｍＲＮＡｏｍａｍｍａａｎｓｅｓｓｒａｍｉｅｓ［Ｊ］．ＪｇＣｅｌｌＢｉｏｌ２０００１５１６１２５７－６８：．，，（）［６３］ＲｏｚｅｌｌｅＤＫ，ＦｉｌｏｎｅＣＭ，ＫｅｄｅｒｓｈａＮ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅａｔｈｗａｓｒｏｍｏｔ：ｅｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｖｉｒａｌｒａｎｕｌｅｓａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｓｐｙｐｇｖｉｍｌｉｃａｔｉ－ｓｒｅｏｎ．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２０１４３４１１２００３１６．ｐ饥：，，（）６４Ｓｉｍｓ－ＨｏｌＫｅｄｅｏｎｌｅＭｒｓｈａＮＤｏｗｅｒＫｅｔａｌ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ［］ｐｙ，，，ａｎｔｉｖｉｒａｌｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｇｒａｎｕｌｅｓｄｕｒｉｎｇｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ口］．ＪＶｉｒｏｌ，２０１１８５４－：１５８１９３．，（）［６５］ＣｈｅｒｎｏｖＫＧ，ＢａｒｂｅｔＡ，ＨａｍｏｎＬ，ｅｔａｌ．民ｏｌｅｏｆｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓｉｎｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅａｓｓｅｍｂｌ：ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｄｎａｍｉｃａｌｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｆａｖｏｒｓｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｇｙｙｙｏｆｍｉｃｒｏｍｅｔｒｉｃｓ任ｅｓｓｒａｎｕｌｅｓｉｎｃｅｌｌｓ口．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００９４２：ｇ］，，２８口）３６５６９－８０．６４ ６ＩｖａｎｏｖＰＡＣｈｕｄｉｎｏｖａＥＭＮａｄｅｚｈｄｉｎａＢＳ．Ｄｉｓｒｕｔｉｏｎｏｆ［句，，ｐｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓｉｎｈｉｂｉｔｓｃｔｏｌａｓｍｉｃｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｒｏｔｅｉｎｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｙｐｐｇｆｏｒｍａｔ－ｉｏｎＥｘｅｌｌＲｅｓ２００３２９０２：２２７３３．［叮ｐＣ，，（）６７ＮａｄｅｚｈｄｉｎａＥＳＬｏｍａｋｉｎＡＪＳｈｐｉｌｍａｎＡＡｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ［］，，，ｏｖｅｒｎｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｍｏｂｉｌｉｔａｎｄｄｎａｍｉｃｓＪ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａｇｇｙｙ［］，１０１８０３３３６１－７１２０．：，（）６８ＤｉｎｈＰＢｅｕｒａＬ－义ＫＤａｓＰＢｅｔａｌ．虹ｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓｒａｍｉｌｅｌｉｋｅ［］，，；ｇ－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓＪ．ＪＶｉｒｏｌ２０１３［］，，８７１－：３７２８３．（）６ａｔｏｈＨＯｋａｍｏＵ）ＴＦｕｋｕｈａｒａＴｅｔａｌ．Ｊａａｎｅｓｅｅｎｃｅｈａｌｉｔｉｓｖｉｍｓ［引Ｋ，，，ｐｐｃｏｒｅｒｏｔｅｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｆｏｎｎａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｈａｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｐｇｇ－ｎｄ－Ｃａｒｉｎ１ａｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｖｉｒａｌｒｏａａｔｉｏｎ．ＪＶｉｒｏｌ２０１３８７Ｔ：４８９５０２．ｐｐｐｇ口］，，（）７０ＭａｔｓｕｋｉＨＴａｋａｈａｓｈｉＭＨｉｕｃｈｉＭｅｔａｌ．ＢｏｔｈＧ３ＢＰ１ａｎｄＧ３ＢＰ２［］，，ｇ，ＧｅｎｅｓＣｅ－ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔ；ｏｓｔｒｅｓｓｒａｎｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｌｌｓ２０１３１８２：１３５ｇ町，，（）４６．ＭａｚｒｏｕｉＲＨｕｏｔＭＥＴｒｅｍｂｌａＳ巧ａｌ．打ａｉｎｏｆｍｅｓｓｅｎ巧ＲＮＡ１７＂，，ｙ，ｐｐｇｇｂＦｒａｇＵｅｔａＲｅｔａｒｄａｔｉｏｎｒｏ１：ｅｉｎｉｎｔｏｃｔｏｌａｓｍｉｃｒａｎｕｌｅｓｎｄｕｃｅｓＸＭｅｎｌｉｙｐｙｐｇｔｒａｎｓｌａｔｏ凸＂－ｉｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ…．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ２００２２４：３００７１７．，，（）？Ｋ６５ 附录１博后期间发表文章列表１ＹｉｎｉｅＳｕｎＳｈｅｎｉｎＹｕＮａＤｉｎＣｈｕｎｃｈｕｎＭｅｎＳｏｎｓｈｕ［］ｇｊ，ｇｑｇ，ｇ，ｇ，ｇＭｅ打ＳｈｉｌｅｉＺｈａｎＹｕａｎＺｈａ打又ｕｓｈｅ打ｉｕＬｅｉ了ａ打ＨｏｎｉｍＧｈｅｎｇ，ｇ，，ｇ〇，，ｇｊ，＊ＣｕｉｉｎＳｏｎＣｈａｎＤｉｎ．ＡｕｔｏｈａＢｅｎｅｆｉｔｓ也ｅ民ｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｇｇ，ｇｐｇｙｐＮｅｗｃａｓｔｌｅＤｉｓｅａｓｅＶｉｍｓｉｎＣｈｉｃｋｅｎＣｅｌｌｓａｎｄＴｉｓｓｕｅｓ口．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ］２０１－Ｖｉｒｏｌｏ１４８８：５２５５３７．ｇｙ，，（）２ＳｈｉｌｅｉＺｈａｎ＃ＹｉｎｉｅＳｕｎ＃ＨｏｎｕｎＣｈｅｎＹａｂｉｎＤａｉＹｕａｎＺｈａｎ［］ｇ，ｇｊ，ｇｊ，，，＊ＳｈｅｎｇｑｉｎｇＹｕ，ＸｕｓｈｅｎｇＱｉｕ，ＬｅｉＴａｎ，ＣｕｉｐｉｎｇＳｏｎｇａｎｄＣｈａｎＤｉｎｇ．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰＫＲ／ｅＩＦ２ａｌｈａｓｉｎａｌｉｎｃａｓｃａｄｅｉｎｈｉｂｉｔｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｇｇｐＮｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ口］．ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，２０１４，１１．［３］ＹｕｑｉａｎｇＣｈｅｎｇ，ＹｉｎｇｊｉｅＳｕｎ，ＨｅｎｇａｎＷａｎｇ，ＹａｘｉａｎＹａｎ，ＣｈａｎＤｉｎｇ，＊ＡｎｄＪｉａｎｈｅＳｕｎ．ＣｈｉｃｋｅｎＳＴＩＮＧＭｅｄｉａｔｅｓ１３Ａｃｔｉｖａｉ出ＩＦＮ：這；ｔｏｎｏｆｅＱ－ＧｅｎｅＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｏｆ也ｅＲＩＧＩＧｅｎｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏ２０１５．口］ｇｙ，Ａｃｃｅｔ；ｅｄ（ｐ）４ＪｉｎｈｕａＣｈｅｎＹｉｎｉｅＳｕｎＸｉａｏｒｏｎＺｈａｎＦａｎｉｎＺｈａｎＳｈｉｌｅｉ［］ｇｇ，ｇｊ，ｇｇ，ｑｇｇ，ＺｈａｎＳｈｅｎｉｎＹｕＸｕｓｈｅｎｉｕＬｅｉＴａｎＣｕｉｉｎＳｏｎＳｏｎＧａｏｇｇ，，，ｇ，，，ｇｑｇＱｐｇｇ＊－ＹａｎｔａｏＷｕＣｈａｎＤｉｎ．Ｔｏｌｌｌｉｋｅｒｅｃｅｔｏｒ３ｉｎｈ化ｉｔｓＮｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅ，ｇｐｖｎ－ｉｒｕｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｔｈｒｏｕｈａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｒｏｉｎ幻ａｍｍａｔｏｒｃｔｏｋｉｎｅｓａｎｄｔｈｅｐｇｐｙｙ－ｎｆｅｒｏｎｔｈ－ｔｅ１ｉｔｅｒａ．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏ２０１４１５９１１ｙｐｗａ：２％７ｐｙ阴ｇｙ，，（）２９４８．＊ｕｃｋ－５ＹｕｉａｎＣｈｅｎＹｉｎｉｅＳｕｎＪｉａｎｈｅＳｕｎ．Ｄｔ：ｏｌｌｌｉｋｅｒｅｃｅｔ；ｏｒ５［］ｑｇｇ，ｇｊ，ｐＴＬ民５ｍｅｌｏｉｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８８ＭＤ８８ａｎｄａｎｔｉｖｉｒａｌ（），ｙ（ｙ）－ｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉ凸ａｎｔｉＮｅｗｃａｓｔｌｅ出ｓｅａｓｅｖｉｍｓＮＤＶｒｅｓｏｎｓｅＪ．Ｊ（）ｐ［］ＶｅｔＳｃｉ２０１４．，［６］王晓旭，孙英杰，下云磊，王桂军，下护＊．ＲＮＡ病毒感染对应激颗－．中国动物传染病学报．２０１４２２４７２８０粒的调控作用：，（）＊［７］ＹｉｎｇｊｉｅＳｕｎ，ＬｕｎａＤｏｎｇ，ＸｉａｏｘｕＷａｎｇ，ＨａｎｇＺｈｅｎｇ，ＣｈａｎＤｉｎｇ．ＮｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅＶｉｍｓＩｎｄｕｃｅｓＳｔａｂｌｅＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｂｏｎａｆｉｄｅＳｔｒｅｓｓＧｒａｎｕｌｅｓｔｏｍａｎｉｕｌａｔｅＶｉｒａｌａｎｄＨｏｓｔＰｒｏｔ；ｅｉｎＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｎｄｆａｃｉｌｉｔａｔｅｐｖｉｒａｌｒｅｌｉｃａｔｉｏｎ．ＳｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｐｇｙ６６ 附录２博后期间申请课题列表１应激颗粒对新城疫病毒复制与先天性免疫的调控机制研究３－主（１４００１４４），国家自然科学基金青年基金，２０１５．１２０１７．１２，持，巧万２应激颗粒在新城疫病毒感染过程中的作用（１４ＹＦ１４０８０００）上海市－２０１４．７２０１７青年科技英才杨帆计划．６，主持，１０，万３应激颗粒在新城疫病毒复制过程中的作用研究（２０１４Ｍ５５０１０７）中一－国博±后科学基金面上等资助，２０１４．７２０１６．７，主持，８万．．４６７
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