柞蚕防御基因defense的克隆、表达与功能分析

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1、３６４分类号；单位代码；１０密级：学号：口７２０４：３８安推卷乂ｆ学位论文昨蚕防御基因柳ｉｗｓｃ的克隆、表达与功能分析ＣｌｏｎｉｎｇＥｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＡｎａｌｓｉｓｏｆａＮｏｖｅｌｄｅｆｅｎｓｅＧｅｎｅｆｒｏｍ，ｐｙＡｎｔｈｅｒａｅａｅｒｎｉｐｙ研究生：张小娟指导教师：刘朝良教授合作指导教师；失傑建副教授申请学位口类级别：理学硕±专业名称；生物化学与分子生物学研巧方向：昆虫生物化学与分子生物学所在学院；生命科学学

2、院答辩委员会主席：或起豕二零一五年六月独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方夕ｈ论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：％签字＊曰期：方３）５年ｔ月曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规

3、定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论文全文数据库》，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）。糸学位论文作者签名：指导教师签名；复韻■＾签字日期：＞皆年６月日签字日期：年！月曰＇ｙ工学位论文作者毕业后去向：通作单位：电话；；信地址；邮编；摘要免疫反应分为两个分支，先天

4、性免疫和获得性免疫,昆虫不具备哺乳动物那样完善的获得性免疫系统,因此先天免疫就成为了其抵抗病原微生物入侵的主要手段，而昆虫的先天免疫又分为细胞免疫和体液免疫两大部分，二者共同作用抵御病原物的侵染。细胞免疫包括吞噬、集结和包囊等作用类型，同时体液免疫主要包括黑色素形成和抗菌肽产生两种机制。柞蚕是一种重要的野生绢丝昆虫，主要分布区域分别在亚洲国家，具有可以作为纺织工业原料利用的价值，而且具备很高的药用和食用经济价值，因此，对柞蚕先天免疫防御相关基因的研究对于提高柞蚕抗病能力具有重要的理论意义，此外，也可以推进鳞翅目其他昆虫相关研究，从而进一

5、步为鳞翅目病虫害的防治提供借鉴。利用分子生物学和生物信息学方法对柞蚕defense基因进行分析研究，得到的主要研究成果有以下几点：1．ApDef基因的克隆及序列分析：通过实验克隆出ApDef基因的cDNA序列，总长677bp，包括编码163个氨基酸的开放阅读框（ORF），以及5’端非编码区(5’UTR)和3’端非编码区(3’UTR)分别为63bp和122bp。预测蛋白分子量约为17kDa，理论等电点为4.74；该蛋白属于亲水性蛋白，有明显的信号肽，没有明显的跨膜结构域，且亚细胞定位在线粒体或其它部位的可能性很小，位于胞外的可能性最大。构

6、建的系统进化树显示柞蚕与天蚕亲缘关系最近，与哺乳动物人和小鼠的距离较远。2.ApDef基因的表达分析：提取柞蚕五龄时期不同组织总RNA，设计特异性引物，进行了实时荧光定量PCR（QRT-PCR）。实验结果显示，选取的组织表达量有明显差异，在脂肪体中表达量最高，血细胞和中肠中有微量表达，表皮中不表达。PCR扩增柞蚕ApDef基因的ORF，连接到pET-28a(+)表达载体，并且转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，用IPTG进行了不同浓度的诱导表达，用SDS-PAGE电泳和Westernblot方法检测验证，表明被诱导的目的蛋白均得到了稳

7、定的表达。用IPTG进行了重组蛋白大量诱导并纯化，制备单克隆抗体。用大肠杆菌，藤黄微球菌和白僵菌处理五龄期柞蚕，提取其不同时间段不同处理方式的柞蚕脂肪体RNA，反转录cDNA，设计特异性引物，进行了实时荧光定量PCR（QRT-PCR）。实验结果显示，ApDef的表达水平与对照相比显著上调，而且在感染12小时后达到最大。这些数据表明，ApDef可能在柞蚕的先天免疫应答中起重要作用。关键词：柞蚕，先天免疫，防御基因，Reeler结构域，实时荧光定量PCR。IAbstractImmunereactionisgenerallydividedin

8、totwobranches,innateimmunityandacquiredimmunity.Insectsdonothaveperfectacquiredimmunesystemlikemammal,t