猪肺组织cdna文库的构建及app ompa酵母双杂交的筛选

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1、分类号Ｓ８ＳＳ．１学号Ｓ２〇ｍＳｊ、四川巧化大学硕女学位论文猪肺組织ｃＤＮＡ文库的构建及ＡＰＰＯｍＡ縣母双杂交的筛选ｐ张倩？？‘指导教师义也田巧巧曹盖斋．．．．教摂．学科专业预防＃陵学轿究方向窗念传染巧２０１５年６月Ｓｉｃｈｕａｎ乂ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＳｕｂｍｉｔｔｅｄ化ＰａｒｔｉａｌＦ山削Ｉｍｅｎｔｏｆ化ｅＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｏ

2、ｆｓｗｉｎｅｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅａｎｄｙｅａｓｔ－ｉｔｈｒｏｔｅｉｎｔｗｏｈｙｂｒｉｄＳｃｒｅｅｎｗＯｕ化ｒｍｅｍｂｒａｎｅｐＡｏｆ拍ｗｐｌｅｔｉｒｏｎｅｕｍｏｎｉａｅｐＺｈａｎｇｉａ曲（ｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｉａｒｙｍｅｄｉｃｉｎｅ）ｑｐＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆ．ＷｅｎｘｉｎｔｉａｎＣａｏｓａｎｉｅｊＣｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ化ｎｅ２０巧附件一论文独御性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究王作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ

3、标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学一位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：抑Ｖ年占月日关于论文使用授巧的声明；本人完全了解四川农业大学有关俱留、使用学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部

4、或部分内容。＾：论文不保密４。□本论文保密，在年解密后适用本授权。＂＂（请在Ｗ上□内划Ｖ）（ＭＩ研究生签名：ｉｓ年＜月日）导师签名：户年６月日摘要猪传染性胸膜肺炎（ｐｏｒｃｉｎｅｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｍａｅＰＣＰ是由胸膜肺炎放线，）一杆苗加舰ｓ／ｅｗＡＰＰ／ｆ邸）引起猪的种呼吸道疾病，该病对养猪生产业造成严重的经济损失。外膜蛋白ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｒｏｔｅｉｎ，ＯＭＰ）是胸膜肺炎放线（ｐ一杆菌的众多毒力因子之。本研究主要进行了猪肺组织ｃＤＮＡ文库构建及ＡＰＰＯｍＡ酵进一Ａ感染猪肺的致病

5、ｐ母双杂交阳性克隆子筛选研究，为步深入研究Ｏｍｐ；机理奠定坚实基础，主要研究工作如下１．猪肺组织ｃＤＮＡ文库的构建与鉴定日齡健康仔猪的肺组织为材料，Ｔｒｉｚｏｌ法提取猪肺组织总ＲＮＡ，分离纯化一ｅｎ反转录酶合成ｃＤＮＡ第－ｍＲＮＡ，Ｗ虹ｖｉｔｒｏｇ链，经ＬＤＰＣＲ扩増得到双链ｃＤＮＡ，再经ＢＤＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮＣｏｌｕｍｎｓ纯化双链ｃＤＮＡ，除去较小的片段，将ｃＤＮＡ与含ＤＮＡ激活ＤＮＡ－ＡＤ）的ＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ连接电转化转入大肠杆有域（酵母表达载体ｐ，１０ＢｃＤＮＡｃＤＮＡ菌ＤＨ感受态中，收获克隆子即为猪肺组织文库，经鉴定最

6、终得到的７Ｕ１．５Ｋ文库总容量为ｌ．ｋｌ０ｃｆ，插入片段平均长度在ｂ左右，文库阳性克隆率为１００％，ｃＤＮＡ证明该试验成功构建了猪肺组织文库，为猪肺部致病茵的致病机理方面的研究奠定了基础。２．ＡＰＰ外膜蛋白ＯｍｐＡ酵母双杂交诱巧质粒构建与鉴定Ｗ猪传染性胸膜肺炎放线杆菌５型野毒株基因组全长序列为模板，特异性引物扩ＯｍＡ片段－增去掉信号肤后的外膜蛋白。将该片段与含有ＤＮＡ结合域（ＤＮＡＢＤ）ｐ－Ｔ７Ｒｅｃ连接ＧＢＫＴ７－ＯｍＡ诱ＰＣＲ和双的酵母表达载体ｐＧＢＫ，获得ｐｐ巧载体，经酶切鉴定均获得大小约为１１〇〇ｂ的条带；将该诱巧载体通过醋酸裡

7、法转入酵母感，ｐ的目Ｈ－受态Ａ１０９细胞中，在加有卡那霉素的ＳＤ／Ｔｒｐ营养缺陷性琼脂培养基上收获转化－Ａ诱巧菌子，即为ｐＧＢＫＴ７Ｏｍｐ，通过对该诱巧菌进行自激活性检测和细胞毒性检－－－－－－测结果：该诱巧在ＳＤ／Ｔｒｐ／Ｈｉｓ、ＳＤＡＴｒｐＡＡｄｅ、ＳＤ／Ｔｒｐ／Ｈｉｓ／Ａｄｅ／Ｌｅｕ缺陷性固体－－／－ｌ培养基上均无克隆生长，且在ＳＤＡＴｒｐ、ＳＤＴｒｐ／Ｘａｇａ生长为白色茵落，表明该诱巧菌不能自主激活报告基因ＨＩＳ３、ＡＤＥ２和ＭＥＬ１；在ＳＤＡＴｒｐ液体培养基培养２２ｈＯＤ－差异．８上ＧＢＫＴ７Ｒｅｃ转化子菌液Ｏ