yeast-two-hybrid.pdf

《yeast-two-hybrid.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分子病毒学实验操作常规(袁正宏课题组)酵母双杂交系统蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA文库研究蛋白相互作用第一部分系统简介1.实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录活化结构域(ActivationDomain,AD)分别来完成的，并且这两个结

2、构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA系统和Gal4系统两种。在LexA系统中，DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录;在Gal4系统中，BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD

3、可以与GAL4上游活化序列（GALUAS）结合但不能引起转录，单独的AD则不能与GALUAS结合，只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD与AD才能与GALUAS结合并且引起报道基因的转录。在BD与AD要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4UASs和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示：GAL4BDGAL4ADbaitcDNA

4、pGBKT7pACT2KanrAmprTrp1Leu2pGBKT7-baitpACT2-cDNAAH109（Trp,Leu,His,Ade表达缺陷株）GAL4ADBaitproteincDNA:proteinGAL4DNA-BDUASPromoterMel/Ade/His/LacZreportergene图一：酵母双杂交系统工作原理11分子病毒学实验操作常规(袁正宏课题组)酵母双杂交系统2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白

5、质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至1mmol/L左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选cDNA文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相

6、互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体—受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。3．酵母双杂交GAL4系统筛选cDNA文库实验流程构建DNA-BD与钓构建于DNA-BD载体的检测钓饵蛋白饵DNA融

7、合的重组目的DNA转化酵母菌自身激活能力质粒AH109酵母中质粒的提阳性克隆在X-文库DNA转化含有取及PCR酶切分α-Gal平板上的DNA-BD载体的酵母菌类初步筛选AH109阳性克隆在X-酵母质粒电转化所得质粒与构建于α-Gal平板上的大肠杆菌KC8，抽DNA-BD载体的目的DNA再次验证，质粒提分离所需质粒再次共转化酵母菌AH109纯化、测序。22分子病毒学实验操作常规(袁正宏课题组)酵母双杂交系统4．GAL系统所用酵母菌株与载体1).GAL系统所用酵母菌株注：菌株AH109可利用所带的HIS3、ADE2、MEL1三个报道基进

8、行筛库。菌株Y187可利用所带的IacZ报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。菌株CG-1945可被用于用环己酰亚胺来分离BD-bait和AD-library质粒。2).GAL系统所用各种质粒33分子病毒学实验操作常规(袁正宏课题组