酵母蔗糖酶的提取及其性质研究分析

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1、...页眉酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究袁某某（西北农林科技大学陕西杨凌）［摘要］采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析，得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法，测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度，对蔗糖酶的性质进行了研究。[关键词]蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量1引言自1860年Bertholet从啤酒酵母（SacchacomycesCerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖

2、苷果糖水解酶）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。2材料与方法2.1实验材料高活性干酵母粉、DEAE纤维束DE-23、0.2mol/LTris-HCL缓冲液、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖、水杨酸、0.4mol/LNaOH溶液2.2实验方法2.2.1蔗糖酶的提取与部分纯化将15g高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于3

3、5℃恒温水浴中搅拌30min。抽提补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，8000r/min离心10min，弃沉淀及脂层，的粗级分Ⅰ。预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗体级分Ⅰ的离心管稳妥地放入水浴中，不断轻摇离心管保存30min。取出离心管，于并于中迅速冷却，4℃，10000r/min,离心10min。取上清液，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为热级分Ⅱ）。将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰盐浴，逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌30min，再冰盐浴10min，以沉淀完全。4℃，10000r/mi

4、n,离心10min，弃去上清液，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存，即醇级分Ⅲ。2.2.2酶活性及酶活力影响因素的研究采用水杨酸试剂显色法，通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力。（1）标准曲线的制作取做好编号的试管，按下表进行实验。管号01234567891020mmol/L葡萄糖/ml0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0葡萄糖/μmol02468101214161820/ml1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0水杨酸试剂/ml2222222222

5、2沸水浴5min，流水冷却，定容至15ml00.1020.1610.2150.2620.3330.3530.3850.4120.4400.479....页脚...页眉(2)反应时间的影响取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456789100.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2乙酸缓冲液pH5.0/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.60.4mol/LNaOH/ml1.0由加酶开始计时蔗糖酶/ml0

6、.40.40.40.40.40.40.40.40.4反应时间/min0136101520304050反应时间到后立即向2~10管加入1ml0.4mol/LNaOH终止反应。并向各管加入2ml3,5-二硝基水杨酸，沸水浴准确煮5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.1160.1870.3140.3940.3230.7170.8321.0041.3290.016生成还原糖μmol/ml0.1620.3730.7510.9890.7781.9502.2922.8033.770（3）pH值的影响取做好编号的试管，按下表进行实验。管号12345

7、6780.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.2乙酸缓冲液pH3.54.04.55.05.56.0pH梯度/ml0.20.20.20.20.20.2/ml0.80.20.4mol/LNaOH/ml1.0蔗糖酶/ml0.60.60.60.60.60.60.660℃准确反应10min0.4mol/LNaOH/ml1.01.01.01.01.01.01.0水杨酸试剂/ml2.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.0211.0331.0221.0691.303

8、1.2621.2140.837生成还原糖μmol/ml2.8902.8572.9973.6933.5713.4282.307（4）温度的影响取做好编号的试管，按下表