鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究

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1、上海交通大学博士学位论文鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究专业名称：生物医学工程作者姓名：李本强指导教师：朱建国上海交通大学博士学位论文鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究专业：生物医学工程研究方向：预防兽医与畜禽产品安全学院：农业与生物学院导师：朱建国研究员作者：李本强二零一五年七月ThesisfortheDegreeofPhilosophyDoctorofShanghaiJiaoTongUniversityRESEARCHONCHICKENINTRABODYAGAINSTTHENEWCASTLEDISEASEVIRUS-PHOSPHOPROTEINAuthor：Benqi

2、angLiAdvisor:JianguoZhuMajor:BiomedicalEngineeringResearchDirection:PreventiveVeterinaryMedicineandLivestockProductsSafetyCollege:SchoolofAgriculturalandBiotechnologyJuly,2015上海交通大学博士学位论文鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体的研究摘要新城疫目前仍是大多数养禽国危害最严重的禽病之一，不仅对养禽业造成危害，还对哺乳动物和人类健康具有潜在的威胁。新城疫由于传染性强，传播速度快，给国家和地区的贸易限制和封锁造成了巨大的经济

3、损失。我国将其列为一类动物疾病。病毒性传染病目前尚没有特异性药物治疗，只能依靠疫苗免疫等进行预防。因此，研究特异高效的抗病毒药物是防治病毒性疫病所面临的一项紧迫课题。近年来出现的反义RNA、RNAi等基因治疗技术，都试图在细胞内对感染的病毒在核酸水平上进行干预，从而达到抑制病毒合成的治疗目的。随着细胞生物学和抗体工程技术的发展，出现了一种新兴细胞内免疫及治疗技术——胞内抗体技术。胞内抗体技术是将小分子抗体导入细胞内引起细胞的一系列生物过程发生改变的技术，该技术通过特异性干扰或阻断细胞内特定生物大分子合成、加工和分泌过程而发挥作用。鉴于新城疫病毒转录复合体蛋白在病毒复制增殖过程中所处的关键环节，

4、本研究拟研制能够与新城疫病毒转录复合体蛋白之一的磷蛋白结合的胞内抗体。通过胞内抗体与P蛋白在NDV感染的细胞内特异性结合，从而对病毒转录复合物形成进行干扰及对病毒增殖进行抑制，为新城疫病毒特效药物的研发以及病毒复制机制的研究提供一种新的思路。为此，本论文从以下几个方面开展研究。1、鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白的单链抗体（scFv）的筛选及鉴定（1）鸡源性单链抗体基因表达文库的建立单链抗体是将抗体的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）通过一段柔性的连接肽（linker）连接所形成的两个可变区首尾相连的单一肽链。通过用NDVVG/GA型疫苗免疫鸡，提取其脾脏总mRNA。设计鸡抗体编码基因特异性引物，

5、采用RT-PCR和PCR技术扩增出抗NDV单链抗体的轻链可变区和重链可变区基因，利用重叠延伸PCR将VH和VL通过一条linker连接起来（VH-linker-VL）构建scFv。将scFv基因克隆于原核表达载体pOPE101-XP，该载体主要用于单I上海交通大学博士学位论文链抗体的表达和筛选。将构建的重组质粒pOPE101-XP-scFv转化感受态细胞E.coliJM109，PCR鉴定为阳性的克隆送检测序。挑选测序正确的阳性克隆经IPTG诱导表达，提取周质腔可溶性scFv，SDS-PAGE检验表达结果证明成功构6建了鸡源性单链抗体表达文库。经计算单链抗体库库容量为3.8×10，可用于下一步单

6、链抗体的筛选。（2）抗新城疫病毒磷蛋白（P）单链抗体的筛选及鉴定根据Genbank中已经发表的禽源性新城疫病毒F48E9磷蛋白的基因序列，设计了一对特异性引物，运用RT-PCR方法从基因组中扩增出P蛋白编码基因的cDNA。P蛋白编码基因全长1287bp，编码429个氨基酸。同时将测序正确的P蛋白基因序列连接原核表达载体构建重组原核表达质粒pET-28a-P，进而表达出P蛋白，为筛选针对磷蛋白的单链抗体提供抗原。以纯化后的新城疫病毒磷蛋白为抗原，建立并优化可用于筛选抗NDV磷蛋白scFv的间接ELISA方法。从上述构建的单链抗体库中进行筛选，获得两株亲和力较高的阳性克隆scFvZL.17和scF

7、vZL.103。对鸡源性抗新城疫病毒磷蛋白单链抗体的基因序列分析，结果表明高变区主要集中于CDR区，碱基变化很大。Westernblot分析表明两株单链抗体都能够与病毒的磷蛋白特异性结合。2、抗新城疫病毒磷蛋白胞内抗体在细胞中的表达及生物活性分析为获得针对NDV磷蛋白的细胞内抗体，本研究将上述两个单链抗体编码基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+），成功构建了针对磷蛋白的胞浆型胞内抗体表达质粒