人肝癌组织中肝癌干细胞的分离培养与鉴定

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1、分类号：R6单位代码：10752密级：公开学号：201200200宁夏医科大学硕士研究生学位论文人肝癌组织中肝癌干细胞的分离培养与鉴定Isolation,CultureandIdentificationofHumanHepaticCancerStemCellsfromHepatocellularCarcinomTissues学位申请人：马俊明指导教师：王琦教授合作指导教师：雷鹏博士申请学位门类级别：医学专业名称：外科学研究方向：肝癌干细胞所在学院：临床医学院论文完成日期：二〇一五年三月宁夏医科大学研究生院Ningxi

2、aMedicalUniversityThesisforApplicationofMaster’sDegreeIsolation,CultureandIdentificationofHumanHepaticCancerStemCellsfromHepatocellularCarcinomTissuesStudent’sName:MaJunmingSupervisor：WangQIProfessorSubjectCategory:MedicineMajor:ExternalMedicineSpecialty:Hepati

3、cCancerStemCellSchool:ClinicalCollegeCompletionDate:Mar.2015宁夏医科大学硕士研究生学位论文摘要I宁夏医科大学学位论文独创性声明宁夏医科大学硕士研究生学位论文摘要人肝癌组织中肝癌干细胞的分离培养与鉴定摘要目的体外分离及培养人肝癌组织中的肝癌干细胞并鉴定其生物学特性。方法收集临床肝癌患者术后肝癌组织，用酶消化法分离肝癌细胞，将其接种于无血清培养基中培养，并在超低粘附24孔板中观察肝癌干细胞克隆球生长情况；用MTT比色法检测肝癌干细胞增值能力；用肝癌干细胞表面标记

4、物CD90、+-+CD133抗体，采用流式细胞仪鉴定并分选CD90细胞、CD90细胞，CD133细胞、-++-+CD133细胞，将4种不同细胞组成CD90细胞CD133细胞、CD90细胞CD133-+--细胞、CD133细胞CD90细胞及CD133细胞CD90细胞，分别接种于裸鼠皮下观察其成瘤能力并记录肿瘤体积；将裸鼠成瘤后的组织进行HE染色。结果在无血清培养基中，肝癌干细胞可以形成少量的细胞克隆球；MTT比色法检测，在连续72小时里，肝癌干细胞克隆球始终处于持续增值状态；采用流式细胞仪检测显示肝癌干细胞表面标记物C

5、D90、CD133阳性率分别是7.2%、+-+-8.8%，并成功分选出CD90细胞、CD90细胞、CD133细胞、CD133细胞，将组++成的4种不同细胞组分别接种于裸鼠皮下，结果显示，CD90细胞CD133细胞、-+-+CD90细胞CD133细胞及CD133细胞CD90细胞在裸鼠体内均形成肿瘤，且++-CD90细胞CD133细胞组在最短时间内出现了较高的致瘤能力。而CD133细胞-CD90细胞在整个过程中未见肿瘤形成。将裸鼠体内的肿瘤经HE染色，其结果与人肝癌组织病理特点相似。结论成功建立了从人肝癌组织中分离培养肝

6、癌干细胞的方法；培养得到的肝癌干细胞能在无血清培养基中形成克隆球，且具有较强的增值能力；部分细胞表+++达CD90细胞和CD133细胞，且在裸鼠体内形成肿瘤；肝癌组织中CD90细胞+和CD133细胞具有肝癌干细胞特性，可能为肝癌干细胞。关键词肝癌组织，肿瘤干细胞，CD133，CD90，裸鼠成瘤II宁夏医科大学硕士研究生学位论文摘要Isolation,CultureandIdentificationofHumanHepaticCancerStemCellsfromHepatocellularCarcinomTissue

7、sABSTRACTObjectiveToisolateandculturehumanhepaticcancerstemcellsfromtissuesofhepatocellularcarcinomaandidentifytheirbiologicalcharacteristics.MethodsHepatocellularcarcinomatissuesfrompatientswithlivercanceraftersurgerywerecollected.Hepaticcancercellswereisolate

8、dbydigestionandculturedintheserumfreemedium,andthesurvivaloftumorsphereswereobservedinultralowadhesion24-wellplates.Besides,theproliferationofhepaticcancercellswasanalysedby