家蚕新突变体4龄幼虫致死基因的定位克隆及功能研究

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1、学校代码：10289分类号：S882.1密级：公开学号：121310001江苏科技大学博士学位论文家蚕新突变体4龄幼虫致死基因的定位克隆及功能研究研究生姓名康乐群导师姓名赵巧玲申请学位类别农学博士学位授予单位江苏科技大学学科专业特种经济动物饲养论文提交日期2015年5月20日研究方向家蚕遗传育种与分子生物学论文答辩日期2015年6月7日答辩委员会主席杨光评阅人2015年6月7日分类号：S882.1密级：公开学号：121310001农学博士学位论文家蚕新突变体4龄幼虫致死基因的定位克隆及功能研究学生姓名康乐群指导教

2、师赵巧玲研究员江苏科技大学二〇一五年六月AThesisSubmittedinFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAgriculturePositionalcloningandFunctionresearchofl-4i(lethalfourinstarlarvae)geneinsilkwrom,BombyxmoriSubmittedbyKangLequnSupervisedbyDoctorZhaoQiaolingJiangsuUniversityof

3、ScienceandTechnologyJune,2015江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月日江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论

4、文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密□，在年解密后适用本授权书。(2)不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日摘要摘要家蚕是一种完全变态昆虫，幼虫期是其整个生活史中生长发育和储存能量的重要阶段，因此幼虫期致死对家蚕生命周期的影响无疑是巨大的，同时也会对养蚕生产造成严重的经济损失。4龄幼虫致死突变（lethalmutantinthefour

5、thinstarlarvae,l-4i）是一种新的幼虫期致死的突变体，本研究在对l-4i突变体遗传分析的基础上，采用图位克隆技术对l-4i的突变基因进行了定位克隆，构建了遗传连锁图，采用qRT-PCR、RNAi、酶活测定和添食特异性抑制剂方法对突变基因进行表达分析和功能验证，证实了家蚕拓扑异构酶基因Bmtop的突变是导致l-4i突变体的主要原因，为进一步研究l-4i突变体致死的分子机制奠定了基础。主要研究成果如下：一、l-4i突变体的表型特征与遗传分析4龄幼虫致死突变（lethalmutantinthefourt

6、hinstarlarvae,l-4i）是在对家蚕品种P33的饲养过程中发现的一种新的幼虫期致死型突变体，其特征为l-4i突变体幼虫在3龄第2天就表现出体型较正常个体小，活力较差，生长发育缓慢的特征，3龄期延长约2天，4龄起蚕后极少进食，生长发育基本停滞，并于4龄第3~4天陆续死亡。遗传分析初步判断该突变体由常染色体上的一个隐性遗传基因控制，且为同质型（l-4il-4i）致死。二、l-4i突变基因的连锁及定位分析根据l-4i突变体的遗传规律可以得出该突变性状是由隐性纯合基因控制的，由于l-4i/l-4i有致死性，我

7、们采用基因型为+/l-4i的雄蛾亲本（P2）与C108的雌性亲本（P1）杂交，通过一雄交二雌的方法组配并筛选杂合型F1代群体；筛选出的F1代个体进行自交或与4龄幼虫致死突变体系统中有性状分离的蛾区的亲本进行正反交回交分别组配F2代，BC1F和BC1M群体。然后用P1、F1和P2筛选了家蚕28个连锁群上具有多态性的SSR分子标记；用约400个BC1F、BC1M和F2代群体确定l-4i突变基因所在的连锁群并进行精细定位。连锁分析结果显示l-4i的突变基因位于家蚕第17连锁群；定位结果显示突变基因位于S2865-204

8、和S2865-148两个多态性标记之间，相距约320kb，包含有18个候选基因。三、l-4i突变基因的鉴定采用RT-PCR方法对位于目标区域内候选基因的转录水平进行了检测但没有找到有明显表达差异的基因，继而又对区域内18个基因的ORF采取克隆测序I江苏科技大学农学博士学位论文以期查找差异基因，结果发现大部分基因的ORF没有差异，只有BMgn007081基因的ORF在突变体