天蚕素的规模化制备及其在断奶仔猪日粮中的应用研究

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1、Ｈｏｍ＾ｉ＾Ｈ未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者）。否则应承著作枚的商业性使用（但纯学术性使用不在此限，担侵权的法律责任。吉林大学博±学位论文原创性声明，独立本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出。本人完全意识到本重要贡献的个人和集体，均已在文中Ｗ明确方式标明声明的法律结

2、果由本人承担。，学位论文作者签名：年／壬月日戶ｆ文＾天蚕素的规模化制备及其在断奶仔猪日粮中的应用研究StudyofLarge-scalePreparationofCecropinandIt’sUtilizationinWeanlingPigDiets作者姓名：李波专业名称：兽医博士研究方向：兽医技术服务指导教师：韩文瑜教授学位类别：兽医博士培养单位：动物医学学院论文答辩日期：2015年12月04日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位盲审专家正高级浙江大学主席王洪斌教授东北农业大学盲审专家正高级四川农业大学委员钱爱东教授吉林农

3、业大学盲审专家正高级甘肃农业大学张西臣教授吉林大学盲审专家正高级华中农业大学张乃生教授吉林大学盲审专家正高级中国农业大学高丰教授吉林大学李建华教授吉林大学冯海华教授吉林大学中文摘要天蚕素的规模化制备及其在断奶仔猪日粮中的应用研究为了给消费者提供优质绿色的动物产品，同时提高我国畜产品的国际竞争力，研制抗生素或化学类生长促进剂的替代物是中国饲料添加剂工业面临的一个重大课题。目前认为抗生素替代品有很多，如植物提取物、微生态制剂、酶制剂以及抗菌肽等，抗菌肽的生物学特性：（1）生物学活性范围广；（2）作用迅速、效果稳定；（3）不易产生耐药性；（4）对包膜病毒、真菌、癌细胞等均有作用；（5）没有药物

4、残留。天蚕素是从蚕蛹中分离的，属于首例发现的动物抗菌肽，在1980年，瑞典科学家G.Boman等人发现的，定名为cecropins。本论文主要筛选得到高效分泌表达天蚕素的枯草芽孢杆菌宿主菌及其中试发酵工艺优化、天蚕素的发酵液分离纯化和初步应用试验。论文的主要结果如下：（1）天蚕素在不同枯草芽孢杆菌的表达含量的比较。将表达载体分别转化入三株宿主菌株后，实现重组天蚕素异源表达，然后用SDS-PAGE和高效液相法比较三株菌株cecropinAD表达量。经SDS-PAGE和高效液相法分析，三株菌株都能产生分子量为3.8kDa的小肽，但经过比较发现重组cecropinAD在宿主菌WB800表达效率

5、最高，含量达到826.72μg/ml。（2）将从实验室筛选得到的宿主菌WB800进行中试发酵工艺优化。本文以枯草芽孢杆菌WB800为供试菌株，依托实验室前期工作基础以Design-Expert响应面分析软件为基础，通过其Box-BehnkenDesign(BBD)来设计实验方法，通过pH值、通风量、转速三个因变量的分析比较，以最终天蚕素产量为唯一响应值，通过设计实验方案，找出最佳发酵工艺条件，为CAD的工业化生产提供数据支持。通过实验我们可以得出，当发酵液的pH值达到7.60，转速达到230r/min，其通风量达到5.00L/h的时候，天蚕素表达量会达到一个理论最高值，即979.98μg

6、/ml,通过三次验证实际含量能达到961.52μg/ml，可以进行产业化生产。（3）以从第一章获得的能高表达量天蚕素菌种WB800为宿主菌，以第二章优化后的发酵工艺进行发酵，获得待纯化的发酵液；根据天蚕素的理化性质首先设计了纯化路线；其次是在纯化的每个步骤进行纯化填料的摸索、条件优化；最后将整个纯化工艺进行贯通，纯化出天蚕素的纯品进行检测、鉴定。研究表明：发酵液经过离子交换层析后收集到的样品用反相色谱的方法检测纯度为69.5%，疏水层析后纯度为87.4%，最终检测天蚕素纯品的纯度为100%；纯品对于G-与G+均有一定的抑制与杀灭作用。（4）将天蚕素饲料添加剂产品加到猪日粮中，观察其对断奶

7、仔猪生长性能和免疫功能的影响。选取体重为8.46±0.12kg的杜×大×长三元杂交猪360头，采用单因子完全随机设计，分为4个处理，每个处理6个重复（栏），每个重复（栏）15头猪，对照组：基础日粮（无药物，玉米-豆粕型）；药物组：基础日粮+25mg/kg维吉尼亚霉素+100mg/kg土霉素+60mg/kg硫酸抗敌素（药物以有效含量计）；天蚕素组：基础日粮+400mg/kg天蚕素；配伍组：基础日粮+250mg/kg天蚕素+50mg/k