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＇心．．：巧－．：．Ｖ＇’在：八表、；＇．站筵：Ｖ．？，－１分类号：Ｓ８ＳＳ．１学校化巧Ｉ１０４１０密级：公巧学号：０２２２０１３０Ｑ２戌Ａ《素文營巧去《化恰Ａ猪肠道产细菌素菌袜的筛选巧鉴定Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｌｃａｔｉｏ田ｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｏｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｏｒｃｉｎｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅｐ申请人：余思巧指导巧脱舰向东规教巧＾濟ｊＳ￡．谢巧援．校外巧导教师：炼如圣离级＃孩师学位种类！兽医硕丈专业领滅Ｉ巧在院（巧）：＾动化科学按术学院＾絶文提交日巧—五年六巧：二〇■ 独创性声明本人声明，所呈交的学位论文，，是在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果并且是自己撰写的。尽我所知，论文中不包，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在江西农业大学或其它教育机构获得学位或证书而使用过的材料一。与我同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为。，由本人承担应有的责任学位论文作者亲笔签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阀和借阐；学校可Ｗ公布论文的全部或部分内容，可Ｕｉ？采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。□不保密，本学位论文属于不＂保密。□Ｖ＂（请在方框内打）学位论文作者亲笔签名：瓜易杜日期：！■〇侣、Ｌ、？指导教师亲笔签名：ＪｆＭ？—日期：如Ｓ、巳？斗 目录目录摘要....................................................................................................................................IAbstract.................................................................................................................................II第一部分文献综述.............................................................................................................11.1细菌素的概念..........................................................................................................11.1.1枯草芽孢杆菌细菌素..................................................................................21.1.2细菌素的理化性质......................................................................................21.1.3细菌素的抗菌谱..........................................................................................21.1.4细菌素的分类..............................................................................................31.2细菌素作用机制.....................................................................................................41.3细菌素与抗生素的区别.........................................................................................41.4细菌素的应用及生产.............................................................................................41.4.1细菌素的应用..............................................................................................41.4.2细菌素的生产...............................................................................................51.5细菌素研究的发展及应用前景.............................................................................6第二部分产细菌素猪肠道活性菌株的筛选...................................................................72.1材料与方法............................................................................................................72.1.1猪肠道菌群样本的采集..............................................................................72.1.2主要培养基的制备......................................................................................72.1.3指示菌株的选择与培养..............................................................................72.1.4产细菌素猪肠道活性菌株的分离..............................................................82.1.5产细菌素活性菌株的筛选..........................................................................82.2结果与讨论............................................................................................................92.2.1产细菌素猪肠道活性菌株的初筛..............................................................92.2.2复筛结果....................................................................................................102.3小结.......................................................................................................................12第三部分筛选菌株盲肠2号的鉴定.............................................................................133.1材料与方法...........................................................................................................133.1.1材料............................................................................................................133.1.2方法............................................................................................................143.2结果.......................................................................................................................173.2.1菌落形态.....................................................................................................17i 目录3.2.2革兰氏染色.................................................................................................173.2.3孔雀绿染色................................................................................................173.2.4生理生化鉴定结果....................................................................................173.2.516SrDNA鉴定........................................................................................183.2.6盲肠2号菌株16SrDNA的序列测定结果..............................................183.2.7同源性分析.................................................................................................193.3小结.......................................................................................................................20第四部分盲肠2号菌株抑菌活性产物生产条件的优化.............................................214.1材料和方法............................................................................................................214.1.1试验菌株及培养条件.................................................................................214.1.2主要培养基组成.........................................................................................214.1.3种子液的制备............................................................................................214.1.4盲肠2号菌生长曲线的测定....................................................................214.1.5盲肠2号菌株产抑菌活性物的最佳pH试验..........................................224.1.6盲肠2号菌株产抑菌活性物的最佳接种量试验....................................224.1.7盲肠2号菌株产抑菌活性物的最佳发酵温度........................................224.1.8不同培养基对盲肠2号菌株产抑菌活性物的影响................................224.2结果与讨论............................................................................................................224.2.1盲肠2号菌株的生长曲线.........................................................................224.2.2盲肠2号菌株抑菌活性产物的生产曲线................................................234.2.3初始pH对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响..................................244.2.4接种量对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响....................................244.2.5不同培养温度对盲肠2号菌株生产抑菌活性物质的影响....................254.2.6不同培养基对盲肠2号菌株产抑菌活性物质的影响............................254.3小结.......................................................................................................................26全文总结.............................................................................................................................27致谢.................................................................................................................................31ii 摘要摘要本研究通过对健康成年猪肠道内生菌群的分离，利用点种法筛选出对临床分离的致病性大肠杆菌有明显抑制作用的肠道活性菌株作为研究对象，通过排除酸、过氧化氢试验、酶解试验来初步确定活性菌株所产抑菌活性产物为多肽或蛋白类物质。通过对活性菌株盲肠2号菌菌落形态、代谢试验及16SrDNA的检测，鉴定其为枯草芽孢杆菌。通过对活性菌株盲肠2号菌生产活性产物时的接种量、初始pH、培养温度、发酵时间、培养基组成的研究，确定了该菌株生产活性物质的最佳条件，为今后进一步开发和利用该活性菌株奠定了基础。主要内容包括以下三个部分：1.猪肠道内生菌群活性菌株的分离。从健康成年猪肠道不同区段（十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠）的菌群中进行肠道内生菌株的分离和培养，分离得到形态特征尽可能不同的菌落共计2317株，以临床分离的致病性大肠杆菌（Escherichiacoli）作为指示菌，点种法对峙培养，将对指示菌具有明显抑菌作用的肠道内生菌株进行分离纯化，作为候选活性菌株。利用牛津杯琼脂扩散法对这些候选活性菌株的发酵上清液的抑菌活性进行检测，排除产酸、过氧化氢的可能后，再进行胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解处理，将酶解后发酵上清抑菌活性明显降低或完全丧失的菌株推定为产蛋白质类抑菌物质的活性菌株，留作进行后续研究。2.活性菌株的鉴定。以活性菌株盲肠2号菌的菌落特征、革兰氏染色，以及各种代谢反应试验结果为依据，初步确定盲肠2号菌株为芽孢杆菌（Bacillus）。进一步通过对盲肠2号菌的16SrDNA测序结果：盲肠2号菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）同源性达到99%以上，鉴定本试验筛选所得盲肠2号菌为枯草芽孢杆菌。3.盲肠2号菌株生产活性产物时的最佳生产条件研究。通过研究不同接种量、初始pH、培养温度、发酵时间、培养基组成对活性菌株盲肠2号菌生产活性产物的影响，结果表明该菌株在利用PCA肉汤，接种量为3％、初始pH为7.0、培养温度为37℃、发酵时间为6h时生产活性物质的抑菌活性最强。关键词：肠道抗病菌、细菌素、菌株分离、发酵条件优化I AbstractAbstractThisstudypresentedtheanti-pathogenicbacteriaisolationfromthegutfloraofhealthyfinishingpigs.StrainswithclearinhibitoryactivitytopathogenicEscherichiacoliindicatorwerecollectedusingaseedingmethod.AlltheactivestrainswerecheckedtheirinhibitoryperformanceafterthetreatmentsoftheirsupernatantbyadjustingpHtoneutralorincubatingwithcatalasetoeliminatetheirinhibitoryactivityfromproducingacidicproductsorhydrogenperoxide.Thereafter,bothtrypsinandpapainwereusedtohydrolyzetheirpeptidesinthesupernatantofeachcandidatestrainculturestoconfirmtheproductionofanti-pathogenicpeptidesorproteins.TheprimestraindesignatedtoMangchang2wasidentifiedasBacillussubtilisaccordingtoitscolonystatusandtheresultsofGram’sstaining,metabolictestand16SrDNAsequencing.FurtherstudywasconductedtooptimizethefermentationconditionsoftheMangchang2strainforproducingthehighestinhibitorysupernatantagainstitsindicator.Therearethreepartsinthisstudy.1.Serialdilutionmethodwasusedtoisolatethecommensalbacteriaindifferentintestinalparts(duodenum,jejunum,ileum,caecum,colonandrectum)ofhealthypigs.Anumberof2317strainswithclearlyuniquecolonymorphologicalcharacteristicswereselected.AclinicisolatedpathogenicEscherichiacolistrainwasusedastheindicatorinthisstudy.Fiftystrainswithaclearinhibitoryzoneindividuallywerecollectedastheactivestrainsaftertwiceantiindicatorcultivationwithaseedingmethod.Fortunately,therewere2strainswiththeproductionofproteinormulti-peptidelikesubstanceaftertheproteolysistestandtheexemptionofproducingacidproductorhydogenperoxide.2.Theprimestrain,Mangchang2wasidentifiedasBacillusaccordingtheresultsofitscolonialmorphology,Gram’sstainingandseveralmetabolictests.Further16SrDNAsequencingconfirmedwithover99%similaritythatMangchang2wasaBacillusSubtilis.3.FurtherstudywasinvestigatedintotheoptimizationofthefermentationconditionsofMangchang2producingbacteriocinlikesubstance.TheresultsshowedtheoptimalconditionforMangchang2producinginhibitorysubstancewasPCAbrothwitha7.0±0.1initialpH,3%inoculumconcentration,andincubatedat37℃for6hours.Keywords:Entericanti-pathogenicbacteria;Bacteriocin；Bacterialstrainsisolation;FermentationconditionsoptimizationII 第一部分文献综述第一部分文献综述在今年“两会”期间，3月7日，广东代表在分组审议政府工作报告时，中国工程院院士钟南山说，目前中国已经是全球细菌耐药最严重的国家之一，抗生素过高的原因，不仅是因为有些医院滥用抗生素，还有另一方面就是国内的养殖业与畜牧业也存在滥用抗生素的现象。钟南山认为，目前我国畜牧业、水产养殖业滥用抗生素的现象普遍，是造成水体抗生素污染的重要原因之一。如今抗生素的滥用问题的确已经成了我国污染的重要原因。抗生素的滥用影响了环境，影响了肉的品质，更影响着人们的健康。这番话引起了与会代表们的热议。事实的确如此，随着农业畜牧业的发展，抗生素的不合理使用，在世界范围内，抗生素耐药菌的产生并感染人类和动物，严重的威胁着人类和动物的健康。使得动物机体出现几乎能耐所有抗生素的“超级细菌”，其成为了桎梏畜牧业进一步发展的关键。而受耐药菌株感染的人和动物每年均以惊人的速度增长！这已经是一个世界性问题。如今若能发现一种能代替抗生素杀菌又无残留、无污染、对人体无害的新产品，成为了人们亟待解决的问题。在这种急需新产品出现来替代抗生素的情况下，细菌素以其作用高效、无残留、耐高温、可被蛋白酶降解等优点。而这些优点都是其它抗生素所没有的，很好的弥补了抗生素的不足，对未来充满着广阔的前景。应对细菌素大力推广并深入研究。据报道动物肠道的细菌数是动物体细胞的10倍之多，从动物肠道筛选产细菌素细菌，这是一种新型的寻找细菌素的重要方向，通过猪肠道筛选分离出能分泌细菌素对多种动物致病菌具有抑杀作用的肠道内生菌，为利用产细菌素肠道内生菌生产益生素和开发细菌素类新型杀菌药物提供条件。1.1细菌素的概念细菌素是由某些细菌在生长代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活[1]性的多肽或前体多肽。对目前已知的大部分革兰氏阳性和阴性菌都具有绝佳的抑杀[2]效果，能够抑制与其有相同或相似生存环境的其他微生物，但其生产菌自身对细菌素有免疫作用。又因其无毒无害，无残留，且难以形成耐药性而被认为是目前抗生素的最佳替代品或补充物之一。大多数的细菌都产生一种或多种细菌素，因而细菌素[3]的产生菌多种多样。一般由革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌或古细菌产生。细菌素是在上个世纪20年代中期首次被发现的,是大肠杆菌V菌株产生的一种可抑制大[4]肠杆菌S生长的热不稳定物质,随后科学家对V菌株分泌物进行分离研究，发现[5]是一种类似于噬菌体，但又不能够自主复制的物质在起作用，并命名为大肠杆菌素。而后在1928年RogersLA等在实验过程中第一次在革兰氏阳性菌中发现类似于大肠[6]杆菌素的代谢物，1933年WhiteheadHR等从乳酸菌分离出一类具有抑菌活性的物[7]质，在1947年将其命名为尼生素(Nisin)，在如今的食品防腐剂中占有重要位置。Jacob和其科学研究搭档在1953年将这种物质称为细菌素。直到Konisly在1982年对细菌素作了明确的定义：细菌素（Bacteriocin）是由细菌在生长代谢过程中通过核1 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定糖体分泌的一种能抑制细菌生长的组成成分为蛋白质的物质，不仅仅局限于对同源细菌的作用，对多种细菌均有抑杀作用，且有自身的抑菌谱，对自身分泌细菌素有免疫[8]性。1.1.1枯草芽孢杆菌细菌素枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）作为公认的益生菌，是安全可靠（generallyregardedassafe，GRAS）的菌种。其产生的细菌素在养殖业和畜牧业中作为绿色饲料添加剂使用，市场前景极其广阔，对人和动物都没有致病性，对畜禽腹泻等疾病有很[9][10]好的预防治疗作用。微生态制剂中使用的益生菌第一大类就是需氧的芽孢杆菌。可以作为益生菌应用的主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽[10]孢杆菌等，芽孢杆菌为需氧菌，在肠道内定植后，迅速消耗环境肠道中的游离氧，维持肠道的厌氧环境，促进有益厌氧菌的生长，产生有机酸类物质，间接抑制其它致病菌生长。芽孢杆菌自身能生成多种消化酶：蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶等酶类。例如淀粉酶可将淀粉转化为单糖，再由肠道中其它细菌将这些单糖转化为乳酸，降低肠道中pH值，从而起到抑制病原菌的作用。能合成多种维生素：B1、B2、烟酸等，提高动物体的免疫能力。还能消除饲料中抗营养因子，使细胞中营养物质释放，同时还能降解饲料中复杂的碳水化合物，帮助动物对营养的吸收。芽孢杆菌和乳酸菌协同作用,可有效抑制消化道中大量致病菌的繁殖,改善消化道的微环境。芽孢杆菌也是一类应用前景非常广阔的产细菌素菌株。细菌素在食品源的腐败菌和致病菌有很好的抑制作用，自身也有一定的热稳定性，对食物的风味保持，延长食品保质期有一定作用。而细菌素是对抑杀细菌具有一[11]定的手段，它可以快速对病原体的活性和特异性产生抑制。细菌素与饲料添加剂中的抗生素有相近的有益作用，能提高动物的性能。而细菌素自身也具有许多抗生素没有的优质特性，比如：抑杀细菌具有选择性、对机体无副作用、无抗药性、易代谢不蓄积，同时还能在低温或高温环境长时间不失效等优质特性，因此细菌素在畜牧业生产中的应用前景必定非常广阔。1.1.2细菌素的理化性质大部分的细菌素具有高度疏水性、良好的热稳定性，并且能耐酸、耐较低温度贮[12]藏，有的细菌素在15℃下储存21天，活性仍然稳定，甚至在100℃下处理10min[13]也几乎保持完全的活力，有的细菌素在pH1和pH11强酸和强碱下还保持了很[14]高的活力，而较多数细菌素在pH较低的条件下作用更强。因为细菌素具有蛋白质特性，对蛋白酶敏感，在经过胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、[15]蛋白酶K等消化酶处理后，其抑菌活力会有很大程度的下降。通常在试验研究中，[16,17]细菌素能否被蛋白酶降解是作为它蛋白特性的鉴定标准。1.1.3细菌素的抗菌谱细菌素的抗菌谱比传统意义的抗生素相对要窄很多。不同细菌所产生的细菌素抗菌谱各不相同。某些革兰氏阳性菌所产生的细菌素只是对其它部分革兰氏阳性菌有抗[18]性。例如革兰氏阳性菌pediocinAcH对大多数革兰氏阳性菌有抗性，革兰氏阳性2 第一部分文献综述菌嗜热杆菌产生的细菌素cerein，其只对其它嗜热杆菌具有抑制作用。而乳酸菌产生的lactococinA只对乳酸菌属中少部分菌株有抗性作用。也有不少细菌素,对革兰氏阳性菌有抗性及对革兰氏阴性菌也有抗菌作用，如nisinA、短乳杆菌等对金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等革兰氏阳性菌表现出很强的抑菌活性，对大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌也有抑菌活性。1.1.4细菌素的分类细菌素种类非常丰富,在生活环境、大自然中大量存在，几乎所有的细菌均可产[3]细菌素。Klaenhammer认为，99％的细菌可以产生一种或多种细菌素，而当前之所以没能分离筛选出很多产细菌素的菌株，是我们对细菌素的关注度以及研究不够[15]。根据产生细菌素菌株的特征，将细菌素分为革兰氏阳性细菌素和革兰氏阴性细菌[14]素。细菌素以生产菌命名，例如枯草芽孢杆菌产生的细菌素称枯草芽孢杆菌素，绿[1]脓杆菌生成的细菌素称绿脓杆菌素。细菌素的研究开始比较集中于革兰氏阴性菌如乳酸菌之类的细菌素，以后研究人员逐步将研究重点转向革兰氏阳性菌产生的细菌素，例如芽孢杆菌。主要原因是该类细菌素的实际应用潜力更广。细菌素根据结构组成、热稳定性、分子量大小等不同将革兰氏阳性菌产生的细菌素分为4类：[19]第Ⅰ类细菌素也称羊毛硫细菌素，是一类经过翻译后加工修饰的细菌素。该类细菌素的典型特点就是在成熟的分子中含有一个或多个羊毛硫氨酸残基或甲基羊毛硫氨酸残基，该类细菌素根据其分子结构的不同又可分为：ⅠA类线型羊毛硫细菌素，含有螺旋状的两性分子，具有19～50个氨基酸残基，分子量2164～3488Da,带2～[15]7个正电荷，以Nisin为主要代表；ⅠＢ类球型羊毛硫细菌素，分子量小于第一类，[15]不含有电荷，分子中也不超过19个氨基酸残基。如细菌素Mersacidin；ⅠＣ类双（多）组份羊毛硫细菌素，以细菌素Lacticin3147为代表。第Ⅱ类是不包含羊毛硫氨酸的细菌素。分子质量小于11kDa,含30～60个氨基酸残基，受热比较稳定。该类细菌素在乳酸菌中大量产生，是近年来开发应用于食品防腐细菌素的主要来源。根据第Ⅱ类细菌素结果功能的不同又可将这类细菌素分为3个亚类：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc。其中Ⅱa是这类细菌素成员中最多的一类，它们的氨基端都含有一段较为保守的序列N-末端序列Tyr-Gly-Asn-Gly-Val和两个半胱氨酸在肽[12]的N末端形成S-S桥，Ⅱa类细菌素是通过作用敏感菌使其细胞膜形成通道而达到杀菌目地的，其结构特点对单胞李斯特菌有很强的抑杀作用。Ⅱb类细菌素例如lactococcinG、lacticinF则是在靶细胞的质膜上形成两种不同的多肽结合而成的通道。[15]Ⅱc类细菌素则是小分子类的细菌素，是靠依附sec分泌途径的细菌素。[20]第Ⅲ类细菌素是那些大分子，分子量大于31kDa，对热不稳定。例如helveticinsJ和lactacinB都属于此类，在革兰氏阳性菌中目前发现不多，抑菌谱较窄，研究也不是很深入。[21]第Ⅳ类为复合型细菌素，环状结构，包含蛋白质和碳水化合物，如leuconocinS即为此类。此类细菌素也未深入研究。3 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定1.2细菌素作用机制[22]产细菌素菌并不是对所有细菌都有作用效果，对特殊菌株的亲和力试验研究发[5]现：菌株的磷酯组成和pH的变化影响抑菌效果。目前将细菌素作用机制分两种：[23]能量依赖性和非能量依赖性。能量依赖性细菌素的主要通过与作用的敏感细菌相结[22]合并依附于它的细胞膜，而使得靶细菌细胞壁和磷脂的合成受阻，形成通透孔道，+使细胞质如K、ATP等的外流。细胞因细胞膜内外能差改变而自溶死亡。这种杀菌模式需要靶菌株具有膜电位。代表细菌素Nisin。而非能量依赖性的细菌素它也破坏细胞膜功能的稳定性，使细菌细胞膜出现亲水通道而死亡。它与目标细菌有无膜电位无关。1.3细菌素与抗生素的区别细菌素与抗生素相似，都由微生物产生，功能上也类似于抗生素，都具自己的抗[24]菌谱，均能够抑杀其它的微生物。如在食品中添加极少量细菌素Nisin，就足以抑[25]制大多数革兰氏阳性菌的生长和繁殖。正是由于细菌素与抗生素具有相似的一些性[24]质和功能，导致人们对细菌素的误解，认为它就是抗生素。事实细菌素和抗生素是不同的，这主要表现在应用范围、基础合成、作用方式、耐药机制、抗菌谱、毒性等[5][22]方面。所有种类的细菌素都是由核糖体合成的，是真正的蛋白类物质。而大部分抗生素的形成则是由微生物通过酶促反应将初级代谢产物转变为结构性的次级代谢[26][27]物。细菌素与抗生素最主要的差别是：大部分细菌素只对生长环境相似的细菌[28]有损害作用，自身具有免疫性，无残留、具有很好的抗逆性、无抗原性、可加工、[29]具有无毒、无抗药性、无副作用、可被体内蛋白酶降解、同时也无污染等优点。因[30]而，细菌素在部分情况下可代替抗生素使用。而抗生素抑杀细菌时不区分有益与有害的细菌，除部分耐受菌外，其余菌都是抗生素的靶细菌。抗生素，容易在体内堆积，[31]产生耐药菌，也容易出现问题食品。1.4细菌素的应用及生产1.4.1细菌素的应用1.4.1.1细菌素在食品中的应用近年来，三聚氰胺奶粉、苏丹红鸡蛋、孔雀绿鱼虾、甲醛奶糖、瘦肉精、带花黄瓜、爆炸西瓜、染色花椒、地沟油、墨汁石蜡红薯粉、假牛肉等食品问题频繁的出现，使得人们对食品健康问题异常敏感，关注度尤为突出。天然、健康、生态有机的食品已成为许多消费者的追求。当然食品也有自己的保质期，在生产、加工及运输过程中[32]易受到各种各样微生物、细菌的污染而导致腐败变质，造成环境的污染和巨大的经济损失。食品行业长期应用化学合成防腐剂来延长食品的安全保鲜期，但是化学合成的防腐剂它有自己的弊端，它的添加会影响食品原有的风味，而且对人体健康的影响也很大。目前，各国学者都纷纷致力于研发天然、高效、安全的防腐剂——生物防腐剂。生物防腐剂是存在于生物体体内或者是其分泌的具有抑菌作用的物质，经过人工4 第一部分文献综述[33]提取再加工，最后成为食品防腐剂。生物防腐剂已经成为食品研究领域中的热点之[34]一。1988年乳酸链球菌素(Nisin)作为食品添加剂首次得到FDA的认可，已在全球多个[27]国家作为食品防腐剂推广使用。它作为一种十分重要的天然防腐剂，得到广泛的应用，主要用于罐头食品、饮料、肉类食品、鱼等水产食品、牛奶制品（包括鲜奶、酸[5]奶、奶酪、奶粉等）、酿酒、食品加工等等领域。应用的如此广泛，从而促进了其他不同种类细菌素的研究。一般认为细菌素的添加与其它方式防腐剂的联合应用效果会更好，添加产细菌素的乳酸菌到食品中比直接添加细菌素效果要更好。当然若要在食品中添加细菌素，还必须注意几个问题。首先，对食品的结构和成分应了解清楚，[5]有些成分的存在会直接影响细菌素的活性，对细菌素生存的环境也应考虑，尤其注意是否有蛋白酶的存在，他们都会影响细菌素的活性。乳酸菌细菌素最早是应用于食品行业，经过科学家的相关试验证明产生的细菌素[35][36]是食品安全级别的，无毒无副作用，易被消化道蛋白降解，是无害的，可靠的。2002年Bhunia等对小鼠和兔分别进行静脉注射、皮下注射、和腹腔注射细菌素PediocinAcH，在试验研究时发现，PediocinAcH并没有产生任何不良反应和致死作[37][38]用，这试验说明细菌素对动物和人是无害的。如今细菌素在食品方面的科学研究已较完善。1.4.1.2细菌素在动物生产中的应用[11]目前细菌素主要应用于食品当中，在动物生产方面使用较少，但细菌素与动物[39]生产的联系是越来越密切。细菌素可作为动物饲料的添加剂，是一种绿色环保的新型添加剂。含有细菌素的饲料被动物食用后，细菌素可在动物肠道内形成具有明显优[40]势的益生菌群，抑制或杀死其它的有害菌群，维护动物肠道健康菌群，提高动物健[41]康水平，促进动物生长，减少抗生素类药物的使用，达到保健作用。[39]目前乳酸菌是提到最多的产细菌素菌株，尤其乳酸菌中的一类——乳杆菌：是动物肠道中的优势菌，尤其在家禽的肠道内生菌中占据绝对优势,在维持消化道正常[42]微生物群方面起着决定性的作用。可以利用乳杆菌研制出细菌素，喂食动物进行胃[43]肠道的生态调节。当然很多产细菌素菌株可以作为研究菌群对象，要研究肠道微生[44]物类群与不同细菌素的关系，才可以更好的选择出最有效的细菌素，使它们能够更[43]好地定植于肠道系统中，发挥出最好的功效。随着细菌素在动物方面的深入研究，它的优势已经被越来越多的人关注了解。有研究发现细菌素可以很好的抑制禽类小肠[44]中弯曲杆菌和其它病原菌生长。细菌素还可以代替抗生素作为养禽生产中病源性菌[39]株的控制药物。我国在1994年批准可以使用的益生菌有芽孢杆菌、粪链球菌、乳[45]酸杆菌、酵母菌、米曲菌、黑曲菌。目前国内在这方面研究的还不深，值得更多更深入的研究发现，为今后细菌素在动物中的应用开辟更广阔的空间。1.4.2细菌素的生产细菌素是细菌在生长过程中核糖体分泌的一种蛋白质产物。在培养基中直接混于上清液中，而上清液中的细菌素产量又很低，所以必须对上清中的蛋白产物液进行纯5 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定化。现今为止细菌素纯化方法已较成熟，但不能采用完全相同的方法对大部分的细菌[46]素进行纯化，不同的细菌素要根据自身的特征和来设计不同的试验方法进行相应的[47]纯化策略。总结国内外文献的方法，根据分离细菌素的纯度不同将纯化步骤分为三[46]个阶段：粗提阶段，层析柱纯化阶段，高度纯化阶段。1.4.2.1粗提粗提的重要目的是为了澄清、浓缩和筛选目标蛋白，获得粗产物，粗提产物的浓[46]度约为1%，此纯度的细菌素可以研究其部分理化性质，也是后续纯化的基础。通[48][49]常使用粗提的方法有盐析法、吸附法、有机溶剂沉淀、超滤法、有机溶剂萃取法、[50]酸提取法、细胞吸附-解析法和膜分离技术等。粗提最主要的方法目前为盐析法：而盐析法目前比较常用的是硫酸铵沉淀法，是利用硫酸铵饱和溶液使培养基中的蛋白质凝聚从而从培养基中析出，这个方法最大的缺点就是加入硫酸铵饱和溶液后，菌液呈现一个高盐浓度的状态，导致细菌素的活性降低。1.4.2.2层析柱纯化[51]粗提之后的细菌素种含有大量杂蛋白、杂质，需要进一步试验纯化，以除去其中含有的大量杂质、杂蛋白。纯化后可使细菌素达到约40%-80%纯度。这一纯度的细菌素可以用来做SDS-PAGE和等电聚焦实验。通常在这一步试验需要使用各种柱[46]层析法，包括凝胶层析、离子交换层析、疏水层析。1.4.2.3高度纯化高度纯化是对细菌素进一步深入纯化，除去残余的痕量杂质，纯化后可使样品的[51]纯度高达95%。在这一阶段试验中可采用制备型电泳或制备型HPLC等方法，获[46]得的高纯度样品可达到进行氨基酸测序和质谱分析的试验要求。1.5细菌素研究的发展及应用前景细菌素主要通过发酵提纯的方法制得，具有安全、无毒、适用性广、性能稳定和[52]易于工业化生产等优点，因而受到了越来越多的关注。细菌素作为一种潜在的具有安全无毒高效无残留的新型生物防腐剂，当然细菌素的运用不止局限于食品防腐剂方面，还有更广的应用空间，如医药行业，饲料行业、动物生产行业等，都使细菌素得[53]到更好的利用。细菌素在商业生产中有着无穷的潜力，它的研究应用价值及前景是毋庸置疑的，但是目前限制细菌素大规模应用的原因主要包括部分细菌素的抑菌谱较窄；产量太小，产量不稳定；生产成本高，工业化生产困难等。如今基因工程技术迅速发展，在细菌素方些面的研究有了新进展，人们开始利用[54]基因工程技术来克服过去试验的瓶颈。将目的基因组合到菌种中去，让细菌生长的[17]同时，也表达组合的有益基因，使得菌种在生物体内能够发挥多种有益作用。通过基因工程技术改进细菌素的生产或生成更好的细菌素，适应工业化生产。6 第二部分产细菌素菌株的筛选第二部分产细菌素猪肠道活性菌株的筛选本研究通过从健康成年猪不同肠段的内容物中分离出尽可能多的内生菌菌株，并以临床分离的致病性大肠杆菌作为指示菌，采用点种法筛选对指示菌具有明显抑制作用的肠道内生菌群，然后通过排酸试验、过氧化氢排除试验，以及蛋白酶水解试验，最终筛选出具有产细菌素活性的肠道内生菌菌株。2.1材料与方法2.1.1猪肠道菌群样本的采集从某大型生猪生产加工基地中选择成年健康生长猪2头，利用生猪生产加工基地的生产设备和人员，按正常的屠宰程序，在生猪宰杀后，迅速采集整个猪肠道，分别选择十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的各个肠段，将同一肠段中相邻部分的内容物集中在同一个区域，然后将该区域（约20cm的长度）用棉线分别将两端扎紧，最后将集中有肠道内容物的区段剪下即为一个肠段菌群样品。不同肠道部分因为长度及内容物的含量相差较大，因此所得肠段样品数目也不一样，其中空肠最多，其次为结肠、盲肠、十二指肠、回肠和直肠。所有样品控制在20分钟内采样完毕。样品采集后，迅速将各肠段样品置于事先装有无菌生理盐水的自封袋中，再将自封袋密封后放入装有冰袋的保温盒中转运回实验室，置于4℃的冰箱内，以供后续菌群分离筛选。2.1.2主要培养基的制备2.1.2.1PCA平板的制备按PCA（PlateCountAgar）培养基配方（胰蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.25％，葡萄糖0.1％，琼脂1.5％；配方来源：青岛海博生物技术有限公司），准确称量各种营养组分，倒入1000mL锥形瓶中，先加入300～500mL蒸馏水将各营养组分完全溶解，然后加蒸馏水至1000mL，混合均匀后，用0.1M的NaOH和0.1M的HCl调节培养基的初始pH值为7.0±0.1，用棉塞塞住瓶口，置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃条件下灭菌25min。灭菌后的培养基在自然冷却至50～60℃时，无菌操作，将培养基倒入事先经过菌并风干的直径为9cm的玻璃平板中，每个平板倒入约20mL培养基，荡匀，放平，冷凝后备用。2.1.2.2PCA肉汤的制备PCA肉汤是在PCA配方中未加入琼脂组份，其他成分均相同。其配置、灭菌的操作方法同“2.1.2.1PCA平板的制备”中的方法一致。灭菌后冷却至室温即可用于相应菌株的接种培养。2.1.3指示菌株的选择与培养本试验选用临床分离的致病性大肠杆菌作为猪肠道产细菌素菌株筛选的指示菌，该菌株由动物药学实验室保存。指示菌在划PCA平板连续活化2～3代后，挑单菌落至7 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定PCA肉汤，过夜培养至平台期，即可用于抗菌试验中，此时的活菌量约为109cfu/mL。活化好的大肠杆菌每周传代培养1次，以确保其生长活力。2.1.4产细菌素猪肠道活性菌株的分离从4℃冰柜中取出事先采集并保存的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的各肠段样品，无菌操作，用灭菌的生理盐水稀释（冲洗）内容物并搅拌混匀，然后根据各肠段实际所含菌量的不同，将冲洗液进行10倍梯度稀释，不同肠段样品冲洗液的稀释度各有不同，其中十二指肠为10-3，10-4，10-5，空肠为10-2，10-3，10-4，回肠为10-5，10-6，10-7，盲肠、结肠和直肠均为10-4，10-5，10-6。取各稀释液100μL至事先准备好的直径为9cm的已灭菌PCA平板中，用玻璃涂抹棒涂布均匀。平板涂好后，让其静止吸收约15min，然后放入37℃的恒温培养箱内倒置过夜培养，选择菌落分布均匀，且菌落生长良好的平板挑选菌落形态尽可能不同的单一菌落用于活性菌株的筛选。2.1.5产细菌素活性菌株的筛选2.1.5.1初筛无菌操作，将事先活化好的致病性大肠杆菌指示菌稀释100倍，用移液器移取200uL至事先准备好的PCA平板中央，用经过高压灭菌的棉签将菌液在平板上涂布均匀，控制每一平板中指示菌的实际接种量约为106cfu。用记号笔在平板底部将培养基均匀地划分为10～20个方块区域待用。取出事先分离好的猪肠道菌群培养平板，用接种环挑取生长较好，菌落清晰，且尽可能菌落形态或色泽不同的肠道菌单一菌落，将其点种到事先接种好致病性大肠杆菌指示菌的PCA平板不同小方块的中央，每一小方块接种一个菌株，每一平板接种10～20株，接种好后将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养18～24小时。在肠道菌群与标准致病性大肠杆菌的对峙培养中，如果肠道菌株能在涂布致病性。大肠杆菌的平板中形成明显的抑菌圈时，则认为该肠道菌株对致病性大肠杆菌指示菌具有抑制活性，因此初步认定其为具有抗致病性大肠杆菌活性的肠道菌菌株。为了确认所筛菌株的抑菌活性，所有首次筛得的活性菌株在进一步纯化培养后都将重复一次点种试验。两次都能形成明显抑菌圈的菌株则最终保存为备选活性菌株，供后续试验所用。2.1.5.2复筛2.1.5.3酸抑制作用的排除初筛所得的活性菌株经PCA液体培养传代活化后，用第三代菌液作为种子液，以3％的接种量接种于10mL的PCA肉汤中，在37℃，200rpm摇床中培养10h。取5mL菌液于12000rpm离心10min。取上清液，测pH值，同时利用牛津杯琼脂扩散法检测其对大肠杆菌指示菌的抑菌活性。每个牛津杯中加入发酵上清液的量为200μL，PCA检测平板在37ºC培养箱中倒置培养18～24h后检测其抑菌圈的大小。将呈酸性的发酵上清液调至中性，同时配制一相同pH值的盐酸溶液，同样分别采用牛津杯琼脂扩散法检测调整pH值后的发酵上清液及具有相同pH值的盐酸溶液对指示菌的抑菌活性。具体方法同上一步骤。每株备选活性菌株均进行排酸试验，每次试验独立重复三次。通过测量上清液在pH值调整前后对指示菌的抑菌圈的直径变化来判断抑菌物质是否8 第二部分产细菌素菌株的筛选属于有机酸类。2.1.5.4过氧化氢作用的排除挑取经排除酸抑制作用后仍有抑菌活性的菌株，接种于10mL的PCA肉汤，37℃，200rpm摇床培养10h，取5mL菌液，12000rpm离心10min，再取上清900μL，加入100μL浓度为10mg/mL的过氧化氢酶，同时用双蒸水取代酶溶液作空白对照，37℃水浴2h，用牛津杯琼脂扩散法检测处理前后各菌株上清液对大肠杆菌指示菌的抑菌活性。2.1.5.5蛋白酶解试验挑取经排除过氧化氢作用的菌株，接种于10mL的PCA肉汤，37℃，200rpm摇床培养10h，取5mL菌液，12000rpm离心10min，再取上清900μL，各加入100μL浓度为10mg/mL的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，同时用双蒸水取代酶溶液作空白对照，37℃水浴2h，用牛津杯琼脂扩散法检测处理前后各菌株上清液对大肠杆菌指示菌的抑菌活性。2.1.5.6活性菌株发酵上清液抑菌活性的检测－牛津杯琼脂扩散法本试验中所有菌株的发酵上清液、样品处理液及其空白对照液均通过牛津杯琼脂扩散法来检测其是否对指示菌具有抑菌活性。各活性菌株的发酵上清液经12000rpm离心10min后，小心吸取上层无菌体上清液进行抑菌活性检测或进行后续处理后再进行抑菌活性检测。检测活性时，先用灭菌棉签小心在事先准备好的已灭菌PCA平板中均匀涂上一层指示菌，指示菌的接种量约为106cfu每平板，然后将灭菌好的牛津杯小心、均匀地布置在平板上，通常每个平板可以放置2～6个牛津杯。每个牛津杯中加入发酵上清液的量为200μL，然后小心将其转移至37℃培养箱中过夜培养，隔日检测其抑菌圈直径的大小，以此来检测不同菌株对目标指示菌的抑菌活性的大小。2.2结果与讨论2.2.1产细菌素猪肠道活性菌株的初筛本试验从不同的猪肠段中总共筛选出菌落形状清晰的单一菌株共计2317株，其中空肠1048株，十二指肠195株，直肠187株，结肠236株，回肠387株，盲肠264株。在第一次抑菌检测中，共有261株菌株对目标指示菌显示出抑菌活性，筛选得率为11.3％。经纯化后，第二次确认检测，仅有50株对目标指示菌形成明显的抑菌圈，筛选得率为2.2％，具体数据见表2.1。表2.1各肠段活性菌株筛选结果Table2.1Screeningresultsofbacteriafromdifferentpartsofintestine肠段十二指肠空肠回肠盲肠结肠直肠总共筛选菌株总数19510483872642361872317第一批筛出菌株数46916532333261第二批筛出菌株数101013251050第一次筛出得率26%8.7%16.8%1.1%9.8%17.7%11.3%第二次筛出得率5.0%1.0%3.4%0.8%2.1%5.3%2.2%从表2.1中的数据可知，在健康生长猪的正常肠道内生菌群中，不同肠段中都存在有对致病性大肠杆菌具有抑制活性的活性菌株，这说明动物肠道内生菌群对外源致9 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定病菌的抗性是普遍存在的，即广泛存在于动物肠道的每一个部位。动物肠道内生菌群不仅能通过占位排斥及免疫抑制等机制来产生对外源致病菌的抗性，同时还可以通过产生对外源致病菌具有抑杀作用的抗菌性物质来抵御外源致病菌的入侵。此外，本试验结果同时还表明在不同的猪肠道节段，对致病性大肠杆菌具有抑制活性的活性菌株存在的数量是不一样的，其中十二指肠的筛选得率最高，其次为直肠、回肠，这种分布与动物个体自身的天然免疫机制是否存在某种必然关系，还需进一步研究。最后，从表中数据可以看出，不管是从那个肠道筛选出来的活性菌株，经过纯化培养及连续实验室传代培养或保藏后，其抑菌活力都会有所降低，甚至消失的现象。这一现象从本试验的结果来看比较普遍，也即在第二次确认检测中，原本有抑菌活性的菌株中，绝大部分均不再表现出抑菌活性，推测其原因可能是与其肠道生存及实验室培养的条件具有明显差异有关，但还有待更多的试验研究结果来验证。图2.1点种法筛选猪肠道活性菌株Fig2.1Screeningbacteriumstrainsfromporcineintestinebyseedingmethed6说明：1）指示菌为临床分离的致病性大肠杆菌，接种量约为10cfu每平板。2）图中5号菌株为有明显抑菌圈的候选活性菌。2.2.2复筛结果2.2.2.1酸抑制作用的排除在初筛所得的50株活性菌株中，发酵上清液的pH大部分都大于7.0，呈弱碱性，只有6株菌的发酵上清液呈酸性。将呈酸性的发酵上清液调成近中性后，有5株菌株的抑菌圈大小变化不明显，而且相同pH值的盐酸对照液均未对指示菌产生明显的抑菌圈，因此，可以推断其对指示菌产生的抑制作用不是因为其发酵液中的酸抑制作用的结果。然而，也有其中1株菌的发酵上清液经pH调整后抑菌圈完全消失，但相同pH值的盐酸对照液也未对指示菌产生明显的抑制作用，这说明发酵液pH值的改变对其抑菌活性产物的抑菌活性影响很明显，但其抑菌活性物质的抑菌活性也并不是通过产生酸效应来起作用的。因此本试验结果表明，初筛所得50株活性菌中，全部菌株对指示10 第二部分产细菌素菌株的筛选菌的抑制活性均不是因为产生了某种酸的结果。2.2.2.2过氧化氢的排除排除酸可能产生的抑菌作用后，接着将50株活性菌株的发酵上清液进行过氧化氢作用的排除试验。经过氧化氢酶处理后，50株活性菌中有36株的发酵上清液的抑菌活性明显减弱或丧失，而空白对照和阳性对照均对指示菌表现出良好的抑制作用，这个结果说明在这些筛得菌株中，对目标指示菌的抑菌活性有很大一部分是由于产生过氧[55]化氢所致。图2.2过氧化氢排除试验Fig2.2Hydrogenperoxidetest说明：如图所示盲肠2号菌株上清液在过氧化氢酶作用后抑菌活性变化不明显，其它三株抑菌活性明显减弱或丧失。2.2.2.3酶解作用检测结果与过氧化氢酶解试验一样，剩余14株活性菌株发酵上清液均用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶进行处理，然后用牛津杯琼脂扩散法检测其对目标指示菌的抑菌活性。图2.3，结果显示，在这些活性菌株中，只有结肠57号和盲肠2号两株菌的抑菌圈明显减小或丧失。抑菌活性的丧失，说明蛋白酶的处理破坏了其抑菌活性产物的功能，因此，推测其抑菌活性产物为蛋白或多肽类物质，或分子结构中的抑菌活性中心存在肽类结构的活性产物。根据这一分析结果，此两株菌极有可能是产生了某种细菌素，因此将其保种并进行后续相关分析研究。11 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定图2.3蛋白酶解试验结果Fig2.3Proteolyticdigestiontestresults说明:如图所示盲肠2号菌株上清液在木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作用后，抑菌圈明显消失。2.3小结本试验从健康成年猪肠道分离得到形状特征各异的菌株共计2317株，通过点种法，利用致病性大肠杆菌作为目标指示菌，共筛选出50株对大肠杆菌有明显抑制作用的活性菌株。对所有筛选出的活性菌株进行了产酸排除试验、产过氧化氢排除试验和酶解试验的复筛试验，共获得2株活性菌株具有产疑似细菌素的抑菌活性物质，因此将对其进行更进一步的分析研究。12 第三部分筛选菌株盲肠2号的鉴定第三部分筛选菌株盲肠2号的鉴定本部分实验主要是通过对盲肠2号细菌的鉴定。根据菌落形态分析，革兰氏染色、芽孢染色观察，并通过触媒反应进行M.R.试验、V-P试验、吲哚试验以及糖发酵生理生化鉴定。与《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰鉴定细菌学手册第9版》对照鉴定。通过对菌株16SrRNA基因的PCR扩增、凝胶电泳及胶回收，转化连接并通过对16SrDNA基因测定，其同源性与枯草芽孢杆菌约99.9﹪。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1芽孢染色法-孔雀绿染色液配方：孔雀绿5.00g、蒸馏水100ml（此即为孔雀绿饱和水溶液。配制时尽量溶解，过滤使用）。3.1.1.2甲基红（MR）培养基：葡萄糖蛋白胨水。配方：蛋白胨0.7g、磷酸氢二钾0.5g、葡萄糖0.5g、蒸馏水0.5g配制：将上述各成分混于蒸馏水中，加热溶解，调pH值为7.2-7.4，滤纸过滤，分装于小试管内，每管3～5ml，加塞包好，经过121℃灭菌25min后备用。指示剂配方：甲基红0.02g、95％酒精60ml、蒸馏水40ml。3.1.1.3维培二氏试验（VP试验）培养基：同MR试验硫酸铜指试剂：1g硫酸铜溶于40ml氨水中，再加10％氢氧化钠至1000ml。3.1.1.4吲哚（靛基质）试验需氧、兼性厌氧菌用蛋白胨水：蛋白胨1g、氯化钠0.5g、蒸馏水100ml，将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解，调pH值为7.4～7.6，分装试管，121℃灭菌25min。欧利希氏（Ehrlich）试剂：1g对位二甲基苯甲醛溶于95ml无水乙醇后，徐徐加入20ml浓盐酸，避光保存。3.1.1.5试剂PCRMix（购自天根），引物（上海生工合成），双蒸水，琼脂糖（西班牙进口），50×TAE，1×TAE，EB（购自上海生工），0.1%NAD溶液（购自上海生工）等。1%核酸电泳琼脂糖凝胶：称取琼脂糖1g，加入1×TAE100mL，加热溶解，最后加入10ulEB，混匀备用。1×TAE缓冲液：量取50×TAE缓冲液20mL，用双蒸水定容至1000mL备用。10mg/mL溴化乙锭（EB）：按10mg/mL浓度将EB溶于双蒸水中搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。10mol/LNaOH溶液：称取40gNaOH，缓慢溶解于80mL双蒸水中，补充双蒸水定容至100mL；室温保存备用。13 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定3.1.2方法3.1.2.1实验试验菌株的复苏与纯化无菌操作，将试验一分离所得的盲肠2号菌用勾菌环划线连续传代接种于PCA平板中3次进行活化，培养条件为37℃恒温箱中培养20h。接种此菌株到新PCA培养基上传代培养，直到菌体大小、型态、色泽一致为止。3.1.2.2菌落形态观察经过完全活化的盲肠2号菌株，在PCA平板上划线培养，37℃培养24h，对菌[56]落颜色、色泽、边缘整齐性，表面光滑度等进行观察。3.1.2.3革兰氏染色在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灭菌勾菌环取单菌落少许到水滴中，均匀涂抹成菌薄膜，静置五分钟，然后用酒精灯外焰加热固定→滴加草酸铵结晶紫染色l～2min→水洗→加革兰氏碘液覆盖涂面媒染1～3min→水洗，用吸水纸吸除水分→95%乙醇脱色0.5～1min→水洗→0.5%的番红染色液复10～30s→水洗、干燥→油镜镜检。3.1.2.4芽孢染色孔雀绿—沙黄染色法：在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灭菌勾菌环挑单菌落少许到水滴中均匀涂抹成菌薄膜，静置五分钟，然后用酒精灯外焰加热固定，滴加5%孔雀绿水溶液于其上加热30～60s，使其产生蒸汽3～4次，水洗30s;以0.5%沙黄水溶液复染30s，水洗，吸干玻片，镜检。3.1.2.5甲基红（MR）试验1）将筛选菌株盲肠2号接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48h。2）取少量培养液于另一小试管中，加入几滴甲基红指示剂，观察颜色变化，若无颜色变化可继续培养4～5d再进行试验3.1.2.6维培二氏试验（VP试验）1）将筛选菌株盲肠2号接种于葡糖糖蛋白胨水培养基中，置于37℃培养48h。2）取少量培养液于另一小试管中，加几滴硫酸铜指示剂，观察颜色变化。3.1.2.7吲哚（靛基质）试验1）将筛选菌株盲肠2号接种于蛋白胨水培养基中，置于37℃培养48h。2）取少量培养基于另一小试管中，加入几滴指示剂，观察颜色变化。3.1.2.8触媒试验1）用无菌玻璃棒沾取少量3%的过氧化氢滴在干净玻片上，共两滴。2）用同样方法滴两滴生理盐水于另一玻片上。3）用勾菌环勾取纯化后的盲肠2号菌落均匀涂抹在四滴水滴中。3.1.2.9生理生化鉴定试验1）培养纯化的盲肠2号菌株。2）将生化鉴定管液甩至一边，掰断。在无菌条件下勾盲肠2号菌株于鉴定管中。3）将勾好的鉴定管平放于培养皿中，放于37℃恒温箱培养24小时。4）每种鉴定管做两次对照。14 第三部分筛选菌株盲肠2号的鉴定3.1.2.10菌株的16SrDNA鉴定3.1.2.11DNA模板的提取16SrDNA的通用引物如下：正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’反向引物1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'用勾菌环勾取单个盲肠2号菌落洗脱于含有50μL无菌双蒸水的1.5mLEP管内。将装有菌的EP管放在沸水中煮5min后迅速放入-20℃冰箱冷冻10min；继续沸水浴5min，放入-20℃冰箱冷冻10min。如此反复三次。待菌液回至室温，于10,000g/min离心1min，取上清，即为盲肠2号菌株DNA模板。3.1.2.12PCR体系10×buffer2.5ulTap酶0.25ulDNTP1ul27F0.5ul1492R0.5ulDNA模板0.5ul双蒸水19.75ul合计25ul3.1.2.13PCR反应条件反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸50s；共进行33个循环，最后72℃再延伸10min。用1%的琼脂糖凝胶电泳来分析扩增产物。加PCR产物5ul，2ul的6×buffer。在90V电压下电泳30～40min。结束后取出胶在紫外分析仪下观看。3.1.2.14胶回收按照试剂盒方法回收：1）切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入无菌离心管（0.89g）中称重，目的条带胶和离心管共计0.93g。凝胶质量为0.04g。如凝胶为100mg，视为100uL。2）加入三倍体积GSB溶液，于55℃水浴融胶6-10min，期间每隔2min混匀一次，观察溶液颜色，若为紫色，加适量醋酸钠（ph=5.2）调整溶液至黄色。3）待融化的凝胶溶液降至室温（高温时吸附柱结合DNA能力弱），加入吸附柱中静置1min，10000g离心1min，弃流出液。4）加入650μLwashingbuffer，10000g离心1min，弃流出液。5）10000g离心1～2min，去除残留的washingbuffer。6）将吸附柱置于一无菌离心管中，开盖静置1min，使残留的液体挥发干净后，[57]在柱子中央加入30μLElutionbuffer或去离子水（pH＞7.0）（EB或去离子水在60～70℃水浴预热，使用效果更好）。室温静置一分钟。15 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定7）10000g离心1min，洗脱DNA，用洗脱液重复洗涤一次，将洗脱出的DNA于-20℃保存。3.1.2.15大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备1）在LB上挑取单个DH5α菌落，接种于3mLLB液体中，37℃培养过夜，150r/min.取上述菌液按1：100接种于3mL新鲜LB液体中，37℃150r振荡2h。2）将细菌放于无菌预冷的1.5mL离心管中，在冰上放置10min,冷却至0℃。3）将培养物4℃5000g/min离心，弃上清，回收细菌。4）每1ml初始培养液加0.6mL预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液（80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2），重悬细菌。5）将溶液于4℃5000g/min离心5min，回收细菌。6）每1mL初始培养物用0.06～0.1mL冰冷的CaCl2重悬细菌，4℃放置，8-24h内使用。3.1.2.16目的基因与pMD19-TVector的连接与转化连接体系如下:目的基因DNA4.5ulPMD19-Tvector0.5ulSolutionΙ5.0ulTotal10.0ul连接物14℃反应过夜，连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α内，涂布于含Amp50µg/mL的LB培养平板中，37℃培养16h。1）用冷却的无菌吸头吸取200μL通过CaCl2溶液制备的感受态细胞悬液至无菌离心管内，每管加入DNA（不超过10μL体积，其中的DNA小于50ng），轻轻旋转以混匀混合物，在冰上放置30min。2）将冷却过的离心管放入预热为44℃的水浴锅，孵育90s，期间禁止摇动。3）将离心管快速转移至冰浴体系中，使菌体细胞冷却1～2min。4）每管菌体加入200μLLB培养基，水浴加温至37℃，保持45min，期间间断轻摇离心管，以此复苏抗性基因。5）将离心管内菌体平铺含Amp50µg/mL的LB培养平板中，37℃培养12～16h。3.1.2.17测序将培养出的菌株通过PCR电泳实验，将菌株拿去上海生工测序。3.1.2.18菌种保存3.1.2.18.1冻干管保存1）将单个纯菌落勾于装有10mlPCA肉汤的灭菌试管中，斜放于37℃，200r/min的恒温培养震荡器中培养10小时.，即可达到生长的平台期，此时的活菌量约为910cfu/mL。2）冻干管上筛上脱脂棉花，在蒸汽压力灭菌器中121℃中高压25min灭菌。16 第三部分筛选菌株盲肠2号的鉴定3）在无菌条件下，每只灭菌冻干管中注入1ml的平台期菌液，筛好棉花。放于冰箱-20℃4～5h让菌液彻底凝固。4）放于冷冻干燥机内冷冻干燥30h。冷冻干燥机要先预冷30min以上再开泵。5）完全抽干后，先关真空泵，再关制冷机，取出冻干管在酒精喷灯下封口。可放于冰箱-20℃较长时间保存。3.1.2.18.2试管斜面保存1）配制好的pca琼脂培养基分装于普通试管，每管10ml，筛好试管筛。2）将琼脂试管放于蒸汽压力灭菌器中121℃高压25min灭菌。高压完毕取出，无菌条件下斜面放置使其冷却。凝固后，形成一个斜面。3）在无菌条件下，勾菌环接种已纯化的盲肠2号菌株于试管斜面。筛好试管筛，放37℃培养箱培养24h。4）包扎好，防止污染。放入冰箱4℃冷藏保存。每经一个月接种传代一次。3.2结果与分析3.2.1菌落形态经过充分活化并纯化后，如图3.1所示，盲肠2号菌株的菌呈乳白色，直径为3～9mm初期菌落较圆，接触有胶冻状。继续生长菌落形态不规则，边缘不整齐，呈小波浪状，有小分支状。菌落表面粗糙，有皱褶。掀起皱褶表皮，底下呈粘液状。图3.1菌株菌落形态Fig3.1Strainscolonymorphology3.2.2革兰氏染色经革兰氏染色，盲肠2号菌株菌体呈现革兰氏阳性，呈杆状，成对或链状排列，菌体染色具圆端或方端，中间有芽孢，芽孢椭圆、卵圆、圆形。3.2.3孔雀绿染色菌体为红色，中间芽孢为绿色。3.2.4生理生化鉴定结果17 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定表3.1盲肠2号菌株生化鉴定结果Table3.1BiochemicaltestresultsofthestrainsfromMangchang2项目结果项目结果项目结果项目结果3%过氧化氢＋氨对＋麦芽糖＋硫化氢○水杨酸－苯－甘露醇＋卫矛醇－蕈糖－V-P实验＋鸟＋枸橼酸盐－鼠李糖＋山梨醇＋纤＋葡磷－蔗糖＋葡萄糖＋M.R实验－赖＋七叶苷＋乳糖－木糖＋吲哚实验＋棉子糖－肌醇○尿素－靛＋由表中结果可以看出，盲肠2号菌株接触酶反应为阳性，V-P和吲哚实验均为阳性，M.R实验为阴性。葡萄糖、木糖、甘露醇等都产酸。根据菌株菌落及个体形态，革兰氏染色及芽孢染色结果观察结合《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏系统细菌学手册》，初步鉴定盲肠2号菌株为芽孢杆菌。3.2.516SrDNA鉴定图3.2盲肠2号菌株16SrDNA的PCR产物电泳图Fig3.2Electrophoregramresultsof16SrDNAfromMangchang2从图3.2显示M为Marker，1号孔为未加模板的对照组。可以看出盲肠2号菌16SrDNA电泳条带位于Marker所示1500bp左右，因此认为PCR产物扩增成功，根据电泳条带的亮度来看，PCR产物的丰度也适合用于DNA序列的测定。3.2.6盲肠2号菌株16SrDNA的序列测定结果GCAGGGGGGCGGCTATAATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCAT18 第三部分筛选菌株盲肠2号的鉴定GGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGAAACAGGAGG3.2.7同源性分析把本试验扩增的2号菌株16SrDNA基因测序结果与NCBI收录的相关核苷酸序列进行核苷酸同源性分析。相关基因序列为：JQ308589shangdongBacillussubtilis、KP100527chinabacillussubtilis、KJ768404jilinbacillussubtilis、KM226922southkoreabacillssubtilis、KM019837nanjingBacillusmethylotrophicus、km659219chinabacillusmethylotrophicus、KM924829hunanbacillusamyloliquefaciens、KP729134henanBacillusamyloliquefaciens、km974803shanxibacillussp、KF863845jiangsuBacillussp、km817244indiaBacillussiamensis，JAUDKY001为本文16SrDNA测序结果。由表3.2可知，本文扩增的16SrDNA测序结果与相关基因的核苷酸同源性为99.9%，同源性很高，说明该序列为16SrDNA基因序列，分离的菌株为枯草芽孢杆菌。19 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定表3.216SrDNA核苷酸同源性分析结果Tab3.2Identilyanalysisof16SrDNAnucleotidesequence3.3小结进一步对筛选的盲肠2号菌株进行鉴定。经纯化培养，革兰氏染色为阳性，直杆状，有芽孢。触媒反应为阳性，吲哚实验为阳性。M.R实验为阴性。葡萄糖、木糖、甘露醇等都产酸。根据菌株菌落及个体形态，革兰氏染色及芽孢染色结果观察。结合《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏系统细菌学手册》比较，盲肠2号菌株与芽孢杆菌相符，通过16SrDNA的测序鉴定，结果显示盲肠2号菌株与枯草芽孢杆菌相似度达到了99%以上，故可以推断其为枯草芽孢杆菌。20 第四部分盲肠2号菌株抑菌活性产物生产条件的优化第四部分盲肠2号菌株抑菌活性产物生产条件的优化除了细菌本身的遗传特性决定细菌素的产生以外，发酵条件对细菌素的产量有着很大的影响，如培养温度、培养基起始pH值、接种量和培养基的组成成分等，其中[58]以培养基成分和培养温度影响最大。本试验通过检测活性菌株发酵上清液抑菌活性的变化来选择适合盲肠２号菌株生产抑菌活性物资的最佳初始PH、接种量、发酵时间、生产温度及培养基组成。4.1材料和方法4.1.1试验菌株及培养条件1）活性菌株：第二部分试验中筛选所得的盲肠2号菌株。2）指示菌：大肠杆菌。两菌株的培养及保存方法同第二部分试验。4.1.2主要培养基组成PCA肉汤及PCA平板的制备同第二部分试验。其他培养基均购买市售成品培养基干粉，其配制方法均参照使用说明，各培养基的配方组成如下：1）MRS肉汤：蛋白胨1.0%，牛肉浸粉0.8%，酵母浸粉0.4%，葡萄糖2.0%，磷酸氢二钾0.2%，柠檬酸氢二铵0.2%，乙酸钠0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.004%，吐温800.1%，调pH值为6.5±0.2。2）MH肉汤：牛肉粉0.6%，可溶性淀粉0.15%，酸水解酪蛋白1.75%，调pH值为7.3±0.1。3）普通培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，调pH值为7.3±0.1。4）LB肉汤：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，调pH值7.4±0.1。4.1.3种子液的制备取保存在4℃冰箱中的盲肠2号菌斜面保存管1支，无菌操作，接入PCA肉汤中，37℃，静止培养18h，用作种子培养液。每次实验均重新制备种子液，以确保菌种不退化、不污染4.1.4盲肠2号菌生长曲线的测定1）按第二部分试验的操作方法配制PCA肉汤150mL。无菌操作，将其分装至12支事先经过灭菌的25cm玻璃试管中，每支试管分装10mL，并分别标记编号为1～12。2）取各PCA肉汤试管，无菌操作，按3%的接种量，分别将充分振荡均匀的盲肠2号菌种子液迅速接种至各试管中。3）将所有试管同时置于37℃，200rpm摇床中培养。每2小时按编号顺序依次取出一支试管，分别进行活菌计数和离心上清的抑菌活性检。4）每支试管采样完毕完后，将剩余菌液的试管包扎好后迅速至于4℃冰箱中冷藏，待全部样品采集完毕后一起取出，用紫外分光光度计检测各试管菌液的OD600。5）利用活菌计数及OD600绘制盲肠2号菌的生长曲线，利用各时间点的抑菌圈直21 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定径绘制盲肠2号菌的抑菌活性产物生产曲线。4.1.5盲肠2号菌株产抑菌活性物的最佳pH试验分别用1mol/LHCl和1mol/LNaOH调pca肉汤培养基的pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按3%的接种量接种活性菌株盲肠2号菌至各PCA肉汤培养基中，37℃，200rpm培养6小时。取其发酵液各5ml，12000rpm离心10min，然后取上清进行牛津杯抑菌试验，每次做3组平行，量取抑菌圈直径(mm)，以确定适宜的初始pH值。4.1.6盲肠2号菌株产抑菌活性物的最佳接种量试验无菌操作，以1％，2％，3％，4％，5％的接种量各接种种子液于pH为7.0±0.1的PCA肉汤培养基中，37℃，200rpm培养6小时。取其发酵液各5ml，12000rpm离心10min，取上清液进行牛津杯抑菌试验，每次做3组平行，量取抑菌圈直径(mm)，以确定最适宜的接种量。4.1.7盲肠2号菌株产抑菌活性物的最佳发酵温度无菌操作，以3%的接种量接种盲肠2号菌的种子液于pH为7.0±0.1的PCA肉汤培养基中，分别放在25℃、29℃、33℃、37℃、41℃、45℃的恒温培养振荡器中，调节转速200rpm，培养6小时。取其发酵液，12000rpm离心10min，然后取上清进行牛津杯抑菌试验，每次做3组平行，量取抑菌圈直径(mm)，以确定最适发酵温度。4.1.8不同培养基对盲肠2号菌株产抑菌活性物的影响配制PCA肉汤培养基、MRS肉汤培养基、LB肉汤培养基、MH肉汤培养基、普通肉汤培养基。将各培养基pH调至7.0±0.1左右，无菌操作，以3%的接种量接种盲肠2号菌株37℃，200rpm，振荡培养6小时。取其发酵液5ml，12000rpm离心10min，然后取上清进行牛津杯抑菌试验，每次做3组平行，量取抑菌圈直径(mm)，确定最适宜的培养基。4.1.9数据的处理与统计分析不同条件下盲肠2号菌菌株发酵上清液对指示菌的抑菌活性以抑菌圈直径来衡量，不同处理之间利用统计分析软件SPSSStatistics的单因素方差分析ANOVA过程，组间差异显著的，再通过Duncan’s多重比较进行显著性水平分析。4.2结果与讨论4.2.1盲肠2号菌株的生长曲线接种盲肠2号菌后，在本试验条件下，每隔两小时的活菌计数结果及培养液在600nm波长下的吸光度见图4.1。22 第四部分盲肠2号菌株抑菌活性产物生产条件的优化图4.1盲肠2号菌株生长曲线Fig4.1ThegrowthcurveofMangchang2由图4.1中的活菌计数结果可以看出，盲肠2号菌对本试验条件下生长迅速，在接种4小时内就达到了平台期。从图中OD600的结果来看，与活菌计数结果相比较，其对数生长期有所滞后，这一方面可能与培养液中持续增加的死亡细菌细胞数量会增加菌液的OD值有关，另一方面，本试验是采用单管分别接种、培养，且采样后放在4℃冰箱内保存至最后一次采样结束时才集中进行OD600的测定，因此在实际接种量、培养条件及中止培养后的延续生长上都有可能对培养液最终的OD值带来一定的影响。当然，后期活菌数维持相对稳定，而OD仍持续增长正说明了菌液中有大量新增死亡细菌细胞的存在。4.2.2盲肠2号菌株抑菌活性产物的生产曲线对接种盲肠2号菌后24小时内，每2小时采样检测PCA发酵液上清的抑菌活性结果见图4.2。图4.2盲肠2号菌株抑菌活性产物生长曲线Fig4.2GrowthcurveofantibacterialproductsofMangchang2由图4.2中的结果可以看出，盲肠2号菌在对数生长期就开始产生有对目标指示菌23 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定起抑制作用的活性物质，培养至6小时时抑菌活性最强，但随后即迅速下降，且一直保持在一个很低的抑菌活性水平。这一现象正好与大多数细菌素分泌的规律相符，细菌素是一种初级代谢产物，大多出现于对数生长期及平台早期，在生长平台期达到最[20]高峰。然而，在大多数已有的报道中，细菌素的生产在达到最高峰后活性迅速下降的现象虽然有，但却不多见。其原因可能是细菌素的生产对生产菌来说是一个消耗能量的活动，当生产菌在自然条件下，能通过产生细菌素来抑制或杀死其它的竞争菌时，因为可以获得更为有利的生存条件而使生产菌的能量消耗得以补偿，但本试验是一个纯培养的过程，因此生产菌产生的细菌素并不能给自己的生存创造更为有利的条件，生产菌生产细菌素的过程就会增加细菌自身的生存负担，在这种情况下，生产细菌就有可能反馈性地迅速停止细菌素的生产，同时启动自身的细菌素降解机制来分解已产生的细菌素。但这一推测还有待于进一步研究论证。从本试验结果来看，对于盲肠2号菌来说，抑菌活性产物的生产收获时间非常关键。本试验结果并未出现抑菌活性产物最佳抑菌活性的平台期，因此，如果有必要的话，还得进一步缩短采样的间隔时间，以获取生产抑菌产物的最佳收获时间。4.2.3初始pH对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响将接种前的培养基pH分别调为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，接种后培养6小时，取发酵液上清对目标指示菌进行抑菌试验，其结果见表4.1。表4.1不同初始pH值对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响Table4.1TheeffectofdifferentinitialpHonantibacterialproductsofMangchang2pH抑菌圈直径（mm）pH抑菌圈直径（mm）pH抑菌圈直径（mm）DeCcDdBbCc4.59.00±0.006.010.25±0.257.511.00±0.71DdeBbBbCc5.09.25±0.256.511.75±0.488.011.00±0.00DdeAaDde5.59.25±0.257.013.25±0.258.59.25±0.25注：带不同小写字母上标者差异显著(p<0.05);带不同大写字母上标者差异极显著(p<0.01)由表4.1可知，培养初始pH由酸性向中性过渡时，随着pH的升高，盲肠2号菌发酵上清液的抑菌活性逐渐增强，当初始pH为7.0时，盲肠2号菌株发酵上清液的抑菌活性最强。当培养液初始pH进一步升高而转向碱性时，随着pH的升高，盲肠2号菌发酵上清液的抑菌活性逐渐减弱。其中初始pH为7.0时，发酵上清液的抑菌活性极显著(p<0.01)地高于其他各处理组。因此，盲肠2号菌株生产活性物质的最佳初始pH即为7.0。4.2.4接种量对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响不同接种量对盲肠2号菌株生产抑菌活性产物的影响见表4.2。从表中可以看出，不同的接种量对盲肠2号菌生产抑菌活性物质也有显著的影响，其中接种量为3%时，盲肠2号菌株生产抑菌活性物质的量最大，与其余各组相比，差异极显著(p<0.01)。因此，为了生产更多的抑菌活性物质，在本试验条件下，盲肠2号菌的最佳接种量应为3%。24 第四部分盲肠2号菌株抑菌活性产物生产条件的优化表4.2不同接种量对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响Table4.2TheeffectsofdifferentconcentrationsofinoculationonantibacterialproductsofMangchang2接种量抑菌圈直径（mm）接种量抑菌圈直径（mm）BbBb1%11.00±0.454%10.75±0.75BbBb2%11.25±0.505%9.75±0.75AaBb3%16.00±1.046%9.75±0.25注：带不同小写字母上标者差异显著(p<0.05);带不同大写字母上标者差异极显著(p<0.01)4.2.5不同培养温度对盲肠2号菌株生产抑菌活性物质的影响按之前已经优化出来的培养条件，接种盲肠2号菌后，分别置于25～45℃的不同温度条件下培养，发酵上清液对指示大肠杆菌的抑菌结果见表4.3。表4.3不同培养温度对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响Table4.3TheeffectsofdifferentculturetemperatureonantibacterialproductsofMangchang2温度（℃）抑菌圈直径（mm）温度（℃）抑菌圈直径（mm）BbcAa2511.00±0.4083715.50±0.645BbBb2911.75±0.2504111.75±0.629BbBc3312.00±0.4084510.25±0.250注：带不同小写字母上标者差异显著(p<0.05);带不同大写字母上标者差异极显著(p<0.01)培养温度是影响细菌发酵的最关键因素之一，从表4.3可知，在37℃时，盲肠2号菌株发酵上清液的抑菌活性最强，与其他组相比均存在极显著(p<0.01)的差异。盲肠2号菌来源于猪肠道，其在37℃时具有最好的产生抑菌活性物质的能力，因此，推测本活性菌株在动物肠道的正常生存活动中也可能产生抑菌活性物质，从这个角度来看，此菌株非常适合作为肠道的益生菌来进行开发，以发挥其在动物肠道抵抗侵入的外源致病菌的作用。4.2.6不同培养基对盲肠2号菌株产抑菌活性物质的影响不同培养基在盲肠2号菌生产抑菌活性物质的最佳生产条件（初始pH为7.0，接种量为3%，37℃发酵6小时。）下发酵上清对目标指示菌的抑菌结果见表4.4。表4.4不同培养基对盲肠2号菌株产抑菌活性产物的影响Table4.4TheeffectsofdifferentculturemediaonantibacterialproductsofMangchang2培养基抑菌圈直径（mm）Bb普通9.75±0.250BbMH9.50±0.289AaPCA23.75±0.479BbLB9.25±0.629BbMRS9.25±0.250注：带不同小写字母上标者差异显著(p<0.05);带不同大写字母上标者差异极显著(p<0.01)25 猪肠道产细菌素菌株的筛选和鉴定从表4.4可以看出，不同培养基的种类对盲肠2号菌生产抑菌活性物质的影响比较明显，PCA是试验所用5种培养基中最佳的生产培养基，其发酵上清液对目标指示菌的抑菌圈达23.8mm，极显著(p<0.01)地高于其他各种选用的培养基。4.3小结本试验经过对盲肠2号活性菌株生产抑菌活性产物发酵条件的优化，结果表明该菌株在用PCA培养液，初始pH为7.0，以3％的量接种，在37℃条件下，培养6小时时其发酵上清液中的抑菌活性物质活性最强，该培养条件可作为该菌株的最佳生产条件。26 全文总结全文总结1）本试验通过从健康成年猪肠道分离出的2317株肠道内生菌，筛选得到50株对临、床分离的致病性大肠杆菌具有明显抑菌作用活性菌株，可供后续试验进一步研究。2）通过排酸试验、排除过氧化氢试验及蛋白酶水解试验等分析，初步确定有2株活性菌株产生的抑菌活性物质为蛋白或多肽类，极有可能是某种细菌素。3）结合细菌表型、代谢特征及16SrDNA基因的鉴定，结果表明活性菌盲肠2号菌为枯草芽孢杆菌。4）对盲肠2号菌株生产抑菌活性物质培养条件的研究，发现其利用PCA肉汤，初始pH为7.0，接种量为3%，在37℃条件下，培养6小时时，发酵产物的抑菌活性最高。特色与创新1）筛选产细菌素肠道内生菌，为新型细菌素抗菌产品的开发提供优质的菌种资源。2）开发产细菌素的肠道益生菌，为益生素产品的开发提供新型优质的菌种资源。3）从动物肠道中分离产细菌素的功能菌，既可充分发掘肠道功能菌的益生作用，又可探索肠道功能菌在动物体内对宿主健康所起的作用。27 参考文献参考文献[1]王涛.肠球菌属细菌素的筛选及其结构基因的表达[D].华中农业大学,2013.[2]GordonDM,O'BrienCL.BacteriocindiversityandthefrequencyofmultiplebacteriocinproductioninEscherichiacoli[J].Microbiology,2006,152(11):3239-3244.[3]解俊梅.植物乳酸菌广谱抑菌成分特性的研究[D].安徽农业大学,2011.[4]A.G.SurunremarquableexempledantagonismeentredeuxsouchesdeColibacille.[J],1925:1040-1041.[5]刘媛媛,冯杰.细菌素在动物生产中的应用前景[J].饲料研究,2005(07):21-23.[6]罗秀针.枯草芽孢杆菌FB123产生的枯草菌素的研究[D].福建师范大学,2008.[7]MattickATR，HirschA．Furtherobservationsonaninhibitorysubstance(nisin)fromlacticstrepto-cocci[J].Lancet,1947,2：5～7[8]管世敏,龚钢明.细菌素及其在食品防腐保藏中应用的研究进展[J].中国酿造,2008(19):1-5.[9]FullerR.Probioticsinhumanmedicine[J].Gut,1991,32:439-442.[10]刘淑英.动物微生态制剂菌种的毒性试验[J].上海畜牧兽医通讯,2009,02:2-3.[11]朱双,张爱忠,姜宁,等.细菌素及其在动物生产中的应用[J].动物营养学报,2014(02):327-333.[12]肖颖.新型抗生素候选替代物——苏云金芽胞肝菌细菌素的初步研究[D].福建农林大学，2011[13]张红星.植物乳杆菌LF_1产细菌素的理化性质研究[J].饲料科学.2010:15-18.[14]尚雅婧,张日俊.细菌素应用的理论与实践[J].饲料与畜牧,2011(07):5-8.[15]谢建华,吴锦瑞,张日俊.细菌素的生物学特性、作用机理和应用[J].饲料工业,2009(16):1-5.[16]KoniskyJ.Colicinsandotherbacteriocinswithestablishedmodeofaction，1982，36：[J]AnnualReviewofMicrobiology:125-144.[17]刘玉恩.泡菜中产细菌素植物乳杆菌的筛选及其所产细菌素生物学特性的研究[D].河北农业大学,2009.[18]郑虹.BacillussubtilisFB123所产细菌素的分离纯化及表征[D].福建师范大学,2006.[19]王蔚璐,凌均棨.变异链球菌密度感应系统调控变链素的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2009,02:165-167.[20]刘宝生,张锦华,罗军荣.细菌素及其应用的研究进展[J].中国畜牧兽医,2013(05):123-128.[21]胡炎华.土壤中明串珠菌的筛选和明串珠菌产细菌素的研究[D].河北工业大学,2010.[22]丁天颖，张平.微生物防腐剂在食品保鲜上的研究与应用[J].保鲜与加工,2005,02:44-45.[23]尚雅婧,张日俊.细菌素应用的理论与实践[J].中国畜牧兽医,2010(05):26-30.[24]饶正华,李丽蓓,高生.细菌素在饲料中的应用[J].中国饲料,2001,24:17-18.[25]李硕.Ⅱa类乳酸菌细菌素的克隆表达研究[D].江南大学,2009.[26]甘晓玲.细菌素在食品工业中的应用价值[J].科学咨询(决策管理),2008,09:48.[27]张建飞,李巧贤.畜牧业生产中细菌素取代抗生素的发展趋势[J].畜牧与饲料科学,2008,01:50-5228 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致谢致谢值此论文最终付梓之际，本人心中感慨万千。两年的研究生生活即将逝去，纵有不舍，但这次真的要与学习生活了六年的大学校园告别了。借此机会，我谨向所有在我成长道路上给予过关心和帮助的人们表示感谢。首先要衷心感谢导师邬向东副教授、刘宝生副教授对我学业生活上的耐心指导，本文从选题、构思到成文都是在两位老师的悉心指导下完成的。两年来，两位老师一直特别注重对我理论与实践相结合的培养，为我提供了许多理论学习和实践的机会。他们严谨的治学态度、踏实的工作风格、渊博的学识都让我收获良多，他们朴实谦和的人格令我钦佩，其言传身教让我受益终身，再次向恩师表达我崇高的敬意，祝愿他们工作顺利，阖家健康。感谢校外兽医院院长陈如圣老师对我实践方面的悉心指导；感谢动物科学技术学院的瞿明仁教授、何后军教授、唐玉新教授、胡国良教授、郭小权教授、王萍教授、游金明教授、曹华斌副教授、王小莺副教授、鲍光明老师、刘立恒老师王立琦老师等传授我学业知识，并对本论文提出的宝贵意见和建议。感谢同宿舍的刘阳、邱志龙，两年的朝夕相处，我们建立了深厚的友谊；感谢师兄张祥华、陶明江、孙明、郑教雀、宋德平，师姐刘婉靖，田光玲，同门潘美慧、钱晶晶、李坤、幸文定、周信荣、赖水明、涂小丽，师弟张帆帆、熊加明、陈茂金等在科研学习过程中给予的帮助和支持；感谢预防兽医点及兽医硕士专业的所有同窗，研究生期间中结识到你们我很欣慰。感谢所有曾经关心、支持和帮助过我的人：瞿明仁老师、廖祥生老师、黄爱民老师、郭小权老师、李辉老师、周健老师、魏德林老师、朱年华老师、许兰娇老师、潘容洲等。感谢你们在我人生中的出现！祝福你们！特别要感谢我最敬爱的父母，我漫漫求学的道路上凝聚着他们无数的心血和汗水，正是他们默默的付出一直激励着我成长进取，他们对我学业的大力支持和精神上不断鼓舞，才让我顺利完成学业，继续朝向人生更远的目标前行。最后，对各位百忙之中抽时间前来参加论文评阅和答辩的专家和老师们致以诚挚的感谢。祝你们身体健康，工作顺利。余恩超2015年5月于江西南昌31
