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1、0234091班81人灾害毒理学实验实验一小鼠胚胎成纤维细胞培养实验一.实验目的明确细胞培养室的建设与日常管理规定，了解细胞培养实验中常用的仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法。二.实验器材与试剂1.主要仪器高压蒸汽灭菌器；超净台；电热干燥箱；口动双重纯水蒸憾器；CO2培养箱；电热恒温培养箱；液氮罐；低温冰箱；超低温冰箱；倒置显微镜(Olympus,Japan)；100ml的玻璃培养瓶;6孔培养板(COSTAR,每孔直径为3.5cm)；Eppendroff管;lml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；5ml冻存管；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿；解剖器械；离心机；漏斗和量
2、筒；培养皿；酒精灯等。2.主要试剂及配制⑴MEF(mouseembryofibroblast,小鼠胚胎成纤维细胞)培养液①低糖DMEM母液用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水；将一小袋低糖DMEM(G1BCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水屮，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗卞所有的粉未。每升培养基中添加3.7gNaHC03o搅拌直至完全溶解。用1NHC1或INNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3,调好PH后，将容器密封(在该实验中用1NHC1调PH至7.3)o立即用0.22閃的滤器过滤除菌，装入高压过
3、的盐水瓶中，4°C保存(1个月内用完)。②MEF培养液取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠(6.25mg)和10mg链霉素,溶解后再次调节PH至7.3,经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶屮，再添加10讷分装好的新生牛血清(NewbornCalfSerum,GIBCO/BRL,需56°C,30min灭活过)，4°C保存至使用。PBS缓冲溶液⑵PPS含0.05%吐温一20的pH7.4的磷酸盐缓冲液的配置在500ml超纯水中依次溶入NaCl4.0g0.lg1.445g0.lgKC1Na2HP04.12H02KH2P04于121°C高压灭菌30min或经
4、0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶小，再放入4°C冰箱小保存备用。(3)0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液的配置在100ml超纯水中分别溶解胰蛋白酶干粉(Trypsin,Sigma,T4799)0.25gEDTA0.02gNaCl0.7gKC10.037gTris0.3gD-葡萄糖0.lg酚红lmg于4°C过夜,使之充分溶解，用Imol/lHCl调PH至7.6,0.22um的滤器过滤除菌，在-10〜30°C下冻存备用。⑷0.1%的明胶水溶液称明胶0.lg（Sigma,G—9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中
5、于121°C高压灭菌45min,于4°C保存。⑸10ug/ml的丝裂霉素C工作液一一刺激成纤维细胞生长的物质一.0.5mg/ml的丝裂霉素C母液在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS,用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4°C避光保存。②10ug/ml的丝裂霉索C工作液在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液,并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临吋配制，并在37°C的C02培养箱中预温30min.o⑹冻存液取2支1.5mlEppendroff管，每管均加
6、入0.9mlDMEM（低糖型）培养液和0・1ml二甲基亚M（DMSO,AR纯，屮国医药集团上海化学试剂公司），置40C冰箱屮预冷60mino3•动物性成熟期即犬于8周龄昆明种小白鼠,领自福建医科人学实验动物中心。三.实验步骤（1）获取小鼠胚胎将8周龄的早鼠和12周龄的$鼠按1:1比例合笼。次日晨10:00前观察2鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。75%酒精消毒后，用普通剪刀和银子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。用眼科弯银和眼科弯剪打开腹腔，暴露出了宫。用眼科弯银夹住一侧
7、子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿屮，洗涤数次。将了宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿了宫系膜打开了宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科银子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。将胎鼠移入另一盛有PBS的平川L中，用眼科剪和眼科银去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿屮，用PBS洗涤两次至
